Escherichia coli O157: kit de detección de ácido nucleico H7 (método de sonda fluorescente PCR/liofilización)
Descripción del equipo:
No gato.FP103
Se utiliza para la detección y el cribado rápidos de E. coli O157:H7 en alimentos, piensos, muestras de agua y muestras ambientales.
Descripciones
Se utiliza paradetección y cribado rápidos de E. coli O157:H7 en alimentos, piensos, muestras de agua y muestras ambientales.
[Principio de prueba]
De acuerdo con el principio de la tecnología de PCR fluorescente, se diseñan cebadores específicos y sondas Taqman para el gen específico de Escherichia coli O157: H7, y se detectan mediante un instrumento de PCR fluorescente, para realizar la detección de Escherichia coli O157: H7. Detección cualitativa de ADN.
Contenido del kit
Nota: la sonda de canal ROX no está incluida.
| Ccomponentes | Especificación | Qcantidad |
| Tampón A | Tubo | 1 |
| Tampón B | Tubo | 1 |
| Control positivo | Tubo | 1 |
| Control negativo | Tubo | 1 |
Uso esperado
Se utiliza para detección y cribado rápidos de E. coli O157:H7 en alimentos, piensos, muestras de agua y muestras ambientales.
Condiciones de almacenamiento y fecha de caducidad
Almacene a -20 ℃ en la oscuridad y evite la congelación y descongelación repetidas.
El período de validez es de 12meses, y la fecha de producción se muestra en el embalaje exterior.
Instrumentos y consumibles
Instrumento de PCR cuantitativa fluorescente, pistola de pipetas y puntas correspondientes, agitador vórtex, mini centrífuga.
Uso
1. Procesamiento de muestras
1.1 Tipo de muestra: este kit es adecuado para alimentos, piensos, muestras de agua y otras muestras que se sospeche que estén contaminadas con Escherichia coli O157:H7.Para productos cárnicos, bebidas y otras sustancias que contienen pigmentos, deben enjuagarse para evitar afectar la recolección de señales de fluorescencia.
1.2 Procesamiento de muestras: Consulte "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examine of Escherichia coli O157: H7 Test" para la preparación de muestras, cultivo de enriquecimiento y aislamiento de Escherichia coli O157: H7.
- Nextracción de ácido ucleico
Tome 20 mL de solución de enriquecimiento en un tubo de centrífuga de 1,5 mL, agregue 200 μL de lisado microbiano (se requiere un kit adicional), agite en vórtice durante 30 segundos, centrifugue brevemente y reserve.
Observaciones: la extracción de ácido nucleico del lisado debe completarse en 10 minutos y no puede almacenarse durante mucho tiempo.
3. Amplificación de ácido nucleico
3.1 Encienda el instrumento de PCR cuantitativa fluorescente para su uso.
Buffer A y Buffer B del kit, derrítalos completamente y centrifugue brevemente.Agregue 18 μL de tampón A y 2 μL de tampón B a cada tubo de reacción de PCR.A continuación, agregue 5 ml de cada control negativo, ácido nucleico extraído y control positivo en los tubos de reacción de PCR, tape los tubos y centrifugue brevemente.
3.3 Transfiera el tubo de reacción de PCR a una máquina de PCR fluorescente y utilice los siguientes procedimientos para realizar experimentos de amplificación: seleccione 25 ml para el sistema de reacción, recopile señales de fluorescencia a 60 °C para cada ciclo y seleccione FAM para el canal de detección.
| Paso | Programa | Número de ciclos |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30s (recoger fluorescencia) |
Guías para el análisis de problemas
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
No se puede extraer ARN o el rendimiento de ácido nucleico es bajo
Por lo general, hay muchos factores que afectan la eficiencia de la recuperación, como: el contenido de ARN de la muestra, el método de operación, el volumen de elución, etc.。
Análisis de causas comunes:
1. Baño de hielo o centrifugación a baja temperatura (4 ° C) durante el funcionamiento.
Sugerencia: Funcionamiento a temperatura ambiente (15-25 °C), nunca en baño de hielo y centrífuga a baja temperatura.
2. Almacenamiento inadecuado de muestras o almacenamiento de muestras durante demasiado tiempo.
Sugerencia: almacene las muestras a -80 ° C o congele en nitrógeno líquido y evite el uso repetido de congelación y descongelación;trate de usar muestras recién recolectadas para la extracción de ARN.
3.Lisis de muestra insuficiente
Recomendación: asegúrese de que la muestra y la solución de trabajo (acrilamida lineal) se hayan mezclado completamente e incubado durante 10 min a temperatura ambiente (15-25 ° C)
4.El eluyente se agregó incorrectamente
Recomendación: asegúrese de agregar ddH2O sin ARNasa en el centro de la membrana de la columna de purificación
5. Volumen inadecuado de etanol anhidro en Buffer viRW2
Sugerencia: siga las instrucciones, agregue el volumen correcto de etanol anhidro al tampón viRW2 y mézclelos bien antes de usar el kit。
6. Uso inadecuado de la muestra.
Sugerencia: 200 µl de muestra por 500 µl de Buffer viRL.Un volumen de muestra excesivo dará como resultado una tasa de extracción de ARN reducida.
7. Volumen de elución inadecuado o elución incompleta.
Sugerencia: el volumen de eluyente de la columna de purificación es de 30-50 μl;si el efecto de elución no es satisfactorio, se recomienda añadir ddH sin ARNasa precalentado2O y extender el tiempo de colocación a temperatura ambiente, como 5-10min
8. La columna de purificación tiene residuos de etanol después de enjuagar en Buffer viRW2.
Sugerencia: si todavía queda etanol después de enjuagar en Buffer viRW2 y centrifugar en tubo vacío durante 2 minutos, la columna de purificación se puede dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos después de la centrifugación en tubo vacío para eliminar completamente el etanol restante.
La degradación de las moléculas de ARN purificadas
La calidad del ARN purificado está relacionada con factores como el almacenamiento de la muestra, la contaminación por ARNasa y el funcionamiento.
Análisis de causas comunes:
1. Las muestras recolectadas no se guardaron a tiempo.
Sugerencia: si la muestra no se usa a tiempo después de la recolección, guárdela a -80 ℃ o nitrógeno líquido inmediatamente.Para la extracción de moléculas de ARN, intente utilizar muestras recién recolectadas siempre que sea posible.
2. Las muestras recolectadas se congelaron y descongelaron repetidamente.
Sugerencia: evite congelar y descongelar repetidamente (no más de una vez) durante la recolección y el almacenamiento de muestras, de lo contrario, disminuirá el rendimiento de ácido nucleico.
3. Se introdujo ARNasa en quirófano o no se utilizaron guantes desechables, mascarillas, etc.
Sugerencia: el experimento de extracción de moléculas de ARN se realiza mejor en una sala de operaciones de ARN separada, y la mesa experimental se limpia antes del experimento.Use guantes y máscaras desechables durante el experimento para evitar la degradación del ARN causada por la introducción de RNase.
4.El reactivo está contaminado por RNase durante el uso.
Sugerencia: reemplace con el nuevo kit de aislamiento de ARN viral para experimentos relacionados.
5. La contaminación por ARNasa de los tubos de centrífuga, las puntas de pipeta, etc. Sugerencia: asegúrese de que los tubos de centrífuga, las puntas de pipeta y las pipetas estén libres de ARNasa.
Las moléculas de ARN purificadas afectaron los experimentos posteriores.
Las moléculas de ARN purificadas por la columna de purificación afectarán los experimentos posteriores si hay demasiados iones de sal o proteínas, como: transcripción inversa, Northern Blot, etc.。
1. Quedan iones de sal en las moléculas de ARN eluidas.
Recomendación: asegúrese de haber agregado el volumen correcto de etanol anhidro al tampón viRW2 y lave la columna de purificación dos veces de acuerdo con la velocidad de centrifugado correcta en las instrucciones de funcionamiento; si aún quedan iones de sal, puede agregar el tampón viRW2 a la columna de purificación y dejarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos.Luego realice la centrifugación para eliminar la contaminación de iones de sal en la mayor medida
2. Hay etanol restante en las moléculas de ARN eluidas
Sugerencia: una vez que confirme que las columnas de purificación han sido enjuagadas por Buffer viRW2, realice una centrifugación en tubo vacío de acuerdo con la velocidad centrífuga en las instrucciones de funcionamiento.Si todavía queda etanol, se puede dejar durante 5 minutos a temperatura ambiente después de una centrifugación en tubo vacío para eliminar el etanol restante en la mayor medida posible.
Manuales de instrucciones:
Manual de instrucciones del kit de aislamiento de ARN viral
