Explicación de términos básicos de biología molecular
1. ADNc y cccDNA: el ADNc es un ADN de doble cadena sintetizado por transcriptasa inversa a partir de ARNm;cccDNA es un plásmido de ADN circular cerrado de doble cadena libre del cromosoma.
2. Unidad de plegamiento estándar: la unidad de estructura secundaria de proteína α-hélice y β-lámina pueden formar bloques estructurales con arreglos geométricos especiales a través de varios polipéptidos de conexión.Este tipo de plegado determinado suele denominarse estructura supersecundaria.Casi todas las estructuras terciarias pueden describirse mediante estos tipos de plegado, e incluso sus tipos combinados, por lo que también se denominan unidades de plegado estándar.
3. CAP: proteína receptora de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) CRP (proteína receptora de cAMP), el complejo formado después de la combinación de cAMP y CRP se denomina proteína activadora CAP (proteína activada por cAMP)
4. Secuencia palindrómica: la secuencia complementaria inversa de un segmento de un fragmento de ADN, a menudo un sitio de enzima de restricción.
5. micRNA: ARN de interferencia complementario o ARN antisentido, que es complementario a la secuencia de ARNm y puede inhibir la traducción de ARNm.
6. Ribozima: ARN con actividad catalítica, que juega un papel autocatalítico en el proceso de empalme del ARN.
7. Motivo: hay algunas regiones locales con forma tridimensional y topología similares en la estructura espacial de las moléculas de proteína
8. Péptido señal: un péptido con 15-36 residuos de aminoácidos en el extremo N durante la síntesis de proteínas, que guía la transmembrana de la proteína.
9. Atenuador: una secuencia de nucleótidos entre una región operadora y un gen estructural que termina la transcripción.
10. Magic Spot: cuando la bacteria crece y se encuentra con una falta total de aminoácidos, la bacteria producirá una respuesta de emergencia para detener la expresión de todos los genes.Las señales que generan esta respuesta de emergencia son el tetrafosfato de guanosina (ppGpp) y el pentafosfato de guanosina (ppGpp).El papel de PpGpp y pppGpp no es solo de uno o unos pocos operones, sino que afecta a un gran número de ellos, por lo que se denominan superreguladores o puntos mágicos.
11. Elemento promotor aguas arriba: se refiere a la secuencia de ADN que juega un papel regulador en la actividad del promotor, como TATA en la región -10, TGACA en la región -35, potenciadores y atenuadores.
12. Sonda de ADN: un segmento marcado de ADN con una secuencia conocida, que se usa ampliamente para detectar secuencias desconocidas y seleccionar genes diana.
13. Secuencia SD: Es la secuencia de unión del ribosoma y el ARNm, que regula la traducción.
14. Anticuerpo monoclonal: Un anticuerpo que actúa solo contra un único determinante antigénico.
15. Cósmido: Es un vector de ADN exógeno construido artificialmente que retiene las regiones COS en ambos extremos del fago y se conecta al plásmido.
16. Detección de manchas azul-blancas: gen LacZ (que codifica la β-galactosidasa), la enzima puede descomponer el sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactósido) para producir azul, lo que hace que la cepa sea azul.Cuando se inserta el ADN exógeno, el gen LacZ no se puede expresar y la cepa es blanca, para detectar las bacterias recombinantes.Esto se llama detección azul-blanca.
17. Elemento que actúa en cis: una secuencia específica de bases en el ADN que regula la expresión génica.
18. Enzima de Klenow: fragmento grande de ADN polimerasa I, excepto que la actividad exonucleasa 5' 3' se elimina de la holoenzima de ADN polimerasa I
19. PCR anclada: se utiliza para amplificar el ADN de interés con una secuencia conocida en un extremo.Se añadió una cola de poli-dG a un extremo de la secuencia desconocida y, a continuación, se usaron el poli-dC y la secuencia conocida como cebadores para la amplificación por PCR.
20. Proteína de fusión: el gen de la proteína eucariota está conectado con el gen exógeno, y la proteína compuesta por la traducción de la proteína del gen original y la proteína exógena se expresa al mismo tiempo.
Otros términos de biología molecular
1. El mapa físico del ADN es el orden en que se organizan los fragmentos (digeridos por endonucleasas de restricción) de la molécula de ADN.
2. La escisión de la RNasa se divide en dos tipos (autocatálisis) y (heterocatálisis).
3. Hay tres factores de iniciación en procariotas que son (IF-1), (IF-2) y (IF-3).
4. Las proteínas transmembrana requieren orientación (péptidos señal), y el papel de las proteínas chaperonas es (ayuda a plegar la cadena peptídica en la conformación nativa de la proteína).
5. Los elementos en los promotores generalmente se pueden dividir en dos tipos: (elementos promotores centrales) y (elementos promotores aguas arriba).
6. El contenido de investigación de la biología molecular incluye principalmente tres partes: (biología molecular estructural), (expresión y regulación génica) y (tecnología de recombinación de ADN).
7. Los dos experimentos clave que demuestran que el ADN es el material genético son (infección por neumococo de ratones) e (infección por fago T2 de Escherichia coli).potencial).
8. Hay dos diferencias principales entre el hnRNA y el mRNA: (el hnRNA se empalma en el proceso de conversión en mRNA), (el extremo 5' del mRNA se agrega con una tapa m7pGppp y hay una poliadenilación adicional en el extremo 3' de la cola ácida (polyA) del mRNA).
9. Las ventajas de la forma de proteína de múltiples subunidades son (la subunidad es un método económico para la utilización del ADN), (puede reducir el impacto de los errores aleatorios en la síntesis de proteínas en la actividad de la proteína), (la actividad puede abrirse y cerrarse de manera muy eficiente y rápida).
10. El contenido principal de la teoría de la primera nucleación del mecanismo de plegamiento de proteínas incluye (nucleación), (enriquecimiento estructural), (reordenamiento final).
11. La galactosa tiene un doble efecto sobre las bacterias;por un lado (puede utilizarse como fuente de carbono para el crecimiento celular);por otro lado (también es un componente de la pared celular).Por lo tanto, se necesita un promotor S2 independiente de cAMP-CRP para la síntesis permanente en el nivel de fondo;al mismo tiempo, se necesita un promotor S1 dependiente de cAMP-CRP para regular la síntesis de alto nivel.La transcripción comienza desde (S2) con G y desde (S1) sin G.
12. La tecnología de ADN recombinante también se conoce como (clonación de genes) o (clonación molecular).El objetivo final es (transferir la información genética del ADN de un organismo a otro organismo).Un experimento típico de recombinación de ADN generalmente incluye los siguientes pasos: (1) Extraer el gen objetivo (o gen exógeno) del organismo donante y conectarlo enzimáticamente a otra molécula de ADN (vector de clonación) para formar una nueva molécula de ADN recombinante.② La molécula de ADN recombinante se transfiere a la célula receptora y se replica en la célula receptora.Este proceso se llama transformación.③ Examine e identifique aquellas células receptoras que hayan absorbido el ADN recombinante.④Cultive las células que contienen ADN recombinante en grandes cantidades para detectar si se expresa el gen de la ayuda externa.
13. Hay dos tipos de replicación de plásmidos: los que están estrictamente controlados por la síntesis de proteínas de la célula huésped se denominan (plásmidos apretados) y los que no están estrictamente controlados por la síntesis de proteínas de la célula huésped se denominan (plásmidos relajados).
14. El sistema de reacción de PCR debe tener las siguientes condiciones: a.Cebadores de ADN (alrededor de 20 bases) con secuencias complementarias en cada extremo de las dos hebras del gen diana a separar.b.Enzimas con estabilidad térmica como: TagDNA polimerasa.c, dNTPd, secuencia de ADN de interés como molde
15. El proceso de reacción básico de la PCR incluye tres etapas: (desnaturalización), (recocido) y (extensión).
16. El proceso básico de los animales transgénicos suele incluir: ①Introducción de un gen extraño clonado en el núcleo de un óvulo fecundado o de una célula madre embrionaria;②Trasplante del óvulo fertilizado inoculado o de la célula madre embrionaria en el útero femenino;③Desarrollo y crecimiento embrionario completo Para la descendencia con genes extraños;④ Utilice estos animales que pueden producir proteínas extrañas como material de reproducción para criar nuevas líneas homocigóticas.
17. Las líneas celulares de hibridoma se generan mediante la hibridación de células (B de bazo) con células (de mieloma), y dado que (las células de bazo) pueden utilizar hipoxantina y (las células óseas) proporcionan funciones de división celular, pueden cultivarse en medio HAT.crecer.
18. Con la profundización de la investigación, la primera generación de anticuerpos se denomina (anticuerpos policlonales), la segunda generación (anticuerpos monoclonales) y la tercera generación (anticuerpos de ingeniería genética).
19. En la actualidad, la ingeniería genética de virus de insectos se centra principalmente en baculovirus, que se manifiesta en la introducción de (gen de toxina exógena);(genes que interrumpen el ciclo de vida normal de los insectos);(modificación de genes de virus).
20. Los factores proteicos que actúan en trans correspondientes a los elementos comunes TATA, GC y CAAT en el promotor de la ARN polimerasa II de mamífero son (TFIID), (SP-1) y (CTF/NF1), respectivamente.
veintiuno.Los factores de transcripción básicos de la ARN polimerasa Ⅱ son TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, y su secuencia de unión es: (D, A, B, E).Donde la función de TFII-D es (vinculante a la caja TATA).
Veintidós.La mayoría de los factores de transcripción que se unen al ADN funcionan en forma de dímeros.Los dominios funcionales de los factores de transcripción que se unen al ADN son comúnmente los siguientes (hélice-giro-hélice), (motivo de dedo de zinc), (motivo de cremallera básica-leucina).
veintitrés.Hay tres tipos de modos de escisión de endonucleasas de restricción: (corte en el lado 5' del eje de simetría para generar extremos cohesivos de 5'), (corte en el lado 3' del eje de simetría para generar extremos cohesivos de 3' (corte en el eje de simetría para generar segmentos planos)).
veinticuatro.El ADN plasmídico tiene tres configuraciones diferentes: (configuración SC), (configuración oc), (configuración L).El primero en electroforesis es (configuración SC).
25. Sistemas de expresión génica exógena, principalmente (Escherichia coli), (Levadura), (Insecto) y (Tabla de células de mamífero).
26. Los métodos comúnmente utilizados para animales transgénicos son: (método de infección retroviral), (método de microinyección de ADN), (método de células madre embrionarias).
Aplicación Biología molecular
1. Nombre las funciones de más de 5 ARN.
ARN de transferencia ARNt ARN de transferencia Aminoácido de transferencia ARN ribosomal ARNr Ribosoma constituye ARN mensajero ARNm Plantilla de síntesis de proteínas ARN nuclear heterogéneo hnRNA Precursor de ARNm maduro ARN nuclear pequeño ARNsn Involucrado en el empalme de ARNn ARN citoplasmático pequeño Proteína scRNA/7SL-RNA Componentes del cuerpo de reconocimiento de señales sintetizadas y localizadas en el retículo plasmático ARN antisentido anRNA/micRNA Regula la expresión génica Ribozima ARN Enzima ARN máticamente activo
2. ¿Cuál es la principal diferencia entre los promotores procarióticos y eucarióticos?
TTGACA procariota --- TATAAT------Sitio de inicio-35 -10 Potenciador eucariota---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Sitio de inicio-110 -70 -25
3. ¿Cuáles son los principales aspectos de la construcción artificial de plásmidos naturales?
Los plásmidos naturales a menudo tienen defectos, por lo que no son adecuados para su uso como portadores para la ingeniería genética y deben modificarse y construirse: a.Agregue genes marcadores de selección adecuados, como dos o más, que sean fáciles de usar para la selección, generalmente genes antibióticos.b.Aumente o disminuya los sitios de corte de enzimas adecuados para facilitar la recombinación.C.Acorte la longitud, corte fragmentos innecesarios, mejore la eficiencia de importación y aumente la capacidad de carga.d.Cambie el replicón, de ajustado a suelto, de menos copias a más copias.mi.Agregar elementos genéticos especiales de acuerdo con los requisitos especiales de la ingeniería genética.
4. Dé un ejemplo de un método para la detección diferencial de ADNc específico de tejido.
Se preparan dos poblaciones de células, el gen diana se expresa o se expresa mucho en una de las células, y el gen diana no se expresa o se expresa poco en la otra célula, y luego se encuentra el gen diana por hibridación y comparación.Por ejemplo, durante la aparición y el desarrollo de tumores, las células tumorales presentarán ARNm con diferentes niveles de expresión que las células normales.Por lo tanto, los genes relacionados con tumores pueden seleccionarse mediante hibridación diferencial.El método de inducción también se puede utilizar para descartar los genes cuya expresión se induce.
5. ¿Generación y cribado de líneas celulares de hibridoma?
Células B de bazo + células de mieloma, agregue polietilenglicol (PEG) para promover la fusión celular, y las células de fusión de mieloma B esplénico cultivadas en medio HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina, T) continúan expandiéndose y nutriéndose.La fusión celular contiene: células de fusión bazo-bazo: incapaces de crecer, las células del bazo no se pueden cultivar in vitro.Células de fusión hueso-hueso: no pueden utilizar hipoxantina, pero pueden sintetizar purina a través de la segunda vía usando folato reductasa.La aminopterina inhibe la folato reductasa y, por lo tanto, no puede crecer.Células de fusión hueso-bazo: pueden crecer en HAT, las células del bazo pueden utilizar hipoxantina y las células óseas proporcionan la función de división celular.
6. ¿Cuál es el principio y el método para determinar la estructura primaria del ADN mediante el método de terminación terminal didesoxi (método de Sanger)?
El principio es utilizar un terminador de cadena de nucleótidos: 2,3,-dideoxinucleótido para terminar la extensión del ADN.Dado que carece del 3-OH necesario para la formación de enlaces 3/5/fosfodiéster, una vez incorporado a la cadena de ADN, la cadena de ADN no puede extenderse más.De acuerdo con el principio de emparejamiento de bases, siempre que la ADN polimerasa necesite dNMP para participar en la cadena de ADN normalmente extendida, hay dos posibilidades, una es participar en ddNTP, lo que resulta en la terminación de la extensión de la cadena de desoxinucleótidos;la otra es participar en dNTP, de modo que la cadena de ADN pueda seguir extendiéndose hasta que se incorpore el siguiente ddNTP.De acuerdo con este método, se puede obtener un grupo de fragmentos de ADN de diferentes longitudes que terminan en ddNTP.El método consiste en dividir en cuatro grupos, respectivamente, ddAMP, ddGMP, ddCMP y ddTMP.Después de la reacción, la electroforesis en gel de poliacrilamida puede leer la secuencia de ADN de acuerdo con las bandas de natación.
7. ¿Cuál es el efecto de regulación positiva de la proteína activadora (CAP) sobre la transcripción?
Proteína receptora de adenilato cíclico (cAMP) CRP (cAMP receptor protein), el complejo formado por la combinación de cAMP y CRP se denomina CAP (cAMPactivated protein).Cuando se cultiva E. coli en un medio carente de glucosa, aumenta la síntesis de CAP, y CAP tiene la función de activar promotores como la lactosa (Lac).Algunos promotores dependientes de CRP carecen de la característica típica de la secuencia de la región -35 (TTGACA) que tienen los promotores comunes.Por lo tanto, es difícil que la ARN polimerasa se una a él.La presencia de CAP (función): puede mejorar significativamente la constante de unión de la enzima y el promotor.Muestra principalmente los siguientes dos aspectos: ① CAP ayuda a la molécula de enzima a orientarse correctamente al cambiar la conformación del promotor y la interacción con la enzima, para combinarse con la región -10 y desempeñar el papel de reemplazar la función de la región -35.②CAP también puede inhibir la unión de la ARN polimerasa a otros sitios en el ADN, lo que aumenta la probabilidad de unión a su promotor específico.
8. ¿Qué pasos suelen incluirse en un experimento típico de recombinación de ADN?
a.Extraiga el gen objetivo (o gen exógeno) del organismo donante y conéctelo enzimáticamente a otra molécula de ADN (vector de clonación) para formar una nueva molécula de ADN recombinante.b.Transfiera la molécula de ADN recombinante a la célula receptora y replíquela y consérvela en la célula receptora.Este proceso se llama transformación.C.Examine e identifique aquellas células receptoras que hayan absorbido el ADN recombinante.d.Cultivar en masa las células que contienen el ADN recombinante para detectar si se expresa el gen de la ayuda externa.
9. Construcción de la biblioteca de genes Se dan tres métodos para seleccionar recombinantes y el proceso se describe brevemente.
Cribado de resistencia a antibióticos, inactivación de resistencia por inserción, cribado de mancha azul-blanca o cribado PCR, cribado diferencial, sonda de ADN La mayoría de los vectores de clonación portan genes de resistencia a antibióticos (antiampicilina, tetraciclina).Cuando el plásmido se transfiere a Escherichia coli, la bacteria adquirirá resistencia y las que no tengan transferencia no tendrán resistencia.Pero no puede distinguir si se ha reorganizado o no.En un vector que contiene dos genes de resistencia, si se inserta un fragmento de ADN extraño en uno de los genes y hace que el gen se inactive, se pueden usar dos controles de placa que contienen diferentes fármacos para detectar recombinantes positivos.Por ejemplo, el plásmido pUC contiene el gen LacZ (que codifica la β-galactosidasa), que puede descomponer el sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactósido) para producir azul, volviendo así la cepa azul.Cuando se inserta el ADN extraño, el gen LacZ no se puede expresar y la cepa es blanca, para detectar las bacterias recombinantes.
10. Explique el proceso básico de obtención de animales transgénicos a través de células madre embrionarias?
Las células madre embrionarias (ES) son células embrionarias durante el desarrollo embrionario, que pueden ser cultivadas y proliferadas artificialmente y tienen la función de diferenciarse en otros tipos de células.Cultivo de células ES: La masa celular interna del blastocisto se aísla y cultiva.Cuando ES se cultiva en una capa sin alimentador, se diferenciará en varias células funcionales, como células musculares y células N.Cuando se cultiva en un medio que contiene fibroblastos, ES mantendrá la función de diferenciación.ES puede manipularse genéticamente y su función de diferenciación puede integrarse sin afectar su función de diferenciación, lo que resuelve el problema de la integración aleatoria.Introduzca genes exógenos en células madre embrionarias, luego implántelos en el útero de ratones hembra embarazadas, desarrolle crías y cruce para obtener ratones homocigóticos.
