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Manuales de instrucciones:Plant Total RNA Isolation Kit Plus Manual de instrucciones

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La columna taponada

Después de tapar la columna, el rendimiento de ARN se reduce o incluso es imposible purificar el ARN, y la masa de ARN obtenida es baja.

Análisis de causa común:

1. Los descansos de muestra no son exhaustivos.

La rotura de la muestra no provoca que la COLUMNA DE LIMPIEZA DE ADN se bloquee por completo, pero afecta el rendimiento y la calidad del ARN.Recomendamos una operación de molienda rápida en suficiente nitrógeno líquido cuando rompa las muestras. Intente aplastar la pared celular de la muestra, la membrana celular y otros tejidos.Para muestras de plantas de poliol polisacáridos, le recomendamos que utilice Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Cuando succione el sobrenadante de la muestra separada con la columna de limpieza de ADN, es posible que se inhale el posible precipitado fragmentado de células.

Los sedimentos de fragmentos de células tomados harán que la columna RNA-ONLY se bloquee cuando se realice la operación de adsorción de RNA (consulte el paso 6).Le recomendamos que tenga cuidado al succionar este sobrenadante para evitar que se succionen restos celulares.

3. La cantidad inicial de la muestra es demasiado.

El uso excesivo de la muestra dará como resultado una fragmentación incompleta de la muestra o una lisis celular incompleta por parte del tampón PSL1, lo que provocará el bloqueo de la columna de purificación durante la purificación.Kit de aislamiento de ARN total de plantas Cada muestra operativa purificada es de 50 mg.Para muestras de plantas de poliol polisacáridos, le recomendamos que pruebe Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. La temperatura de la centrífuga es demasiado baja.

Todo el proceso de aislamiento y purificación del ARN se realiza a temperatura ambiente (20-25°C), excepto que el tejido de la muestra se rompe con nitrógeno líquido. La temperatura de algunas centrífugas criogénicas es inferior a 20℃, lo que puede causar el bloqueo de la columna de limpieza de ADN y/o la columna de solo ARN.Si esto sucede, ajuste la temperatura de la centrífuga a 20-25℃, yasegúrese de que la mezcla de lisis y/o el sobrenadante con etanol agregado se hayan precalentado a 37°C.

No se extrajo ARN o el rendimiento de ARN es bajo

Por lo general, hay muchos factores que afectan la eficiencia de la recuperación, como: el contenido de ARN de la muestra, el método de operación, el volumen de elución, etc.

Análisis de las causas comunes de la siguiente manera:

1. Se realizó un baño de hielo o una centrifugación a baja temperatura (4 °C) durante la operación.

Sugerencia: Operar a temperatura ambiente (15-25°C) en todo el proceso, no haga baño de hielo ni centrifugación a baja temperatura.

2. El ARN se ha degradado debido a una conservación inadecuada de la muestra oa una conservación a largo plazo de la muestra.

Recomendación: las muestras recién recolectadas deben congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y luego almacenarse a -80 ° C durante mucho tiempo, evitar la congelación y descongelación repetidas de las muestras;o sumerja inmediatamente las muestras en solución RNAlater de estabilizador de ARN (muestras de animales).

3. La fragmentación y la lisis insuficientes de la muestra conducen al bloqueo de la columna de purificación.

Sugerencia: Al triturar el tejido, asegúrese de que esté lo suficientemente triturado y transfiéralo rápidamente al tampón PSL1 preparado previamente (confirme que se haya agregado la proporción correcta de β-ME, consulte el paso 1 del procedimiento).

4.El eluyente se agregó incorrectamente.

Sugerencia: asegúrese de que se gotea ddH2O sin ARNasa en el centro de la membrana de la columna de purificación.

5. No se agregó el volumen correcto de etanol absoluto al tampón PSL2 o al tampón PRW2.

Sugerencia: siga las instrucciones, agregue el volumen correcto de etanol absoluto a Buffer PSL2 y Buffer PRW2 y mezcle bien antes de usar el kit.

6. La cantidad de muestra de tejido es inadecuada.

Sugerencia: Utilizar 50 mg de tejido por 500 μl de Buffer PSL1.El uso de demasiado tejido reducirá la cantidad de ARN extraído y también se reducirá la pureza del ARN resultante.Recomendamos encarecidamente que la dosis inicial de la muestra no supere los 50 mg por operación de extracción de ARN.

7. Volumen de elución inadecuado o elución incompleta.

Sugerencia: El volumen de eluyente de la columna de purificación es de 50-200 μl;si el efecto de elución no es satisfactorio, se recomienda extender el tiempo a temperatura ambiente después de agregar ddH2O sin ARNasa precalentada, como 5-10 min.

8. La columna de purificación tiene residuos de etanol después de lavar con BufferPRW2.

Sugerencia: si el tubo vacío se centrifuga durante 1 min y aún queda etanol después del lavado en el tampón PRW2, puede aumentar el tiempo de centrifugado del tubo vacío a 2 min o colocar la columna de purificación a temperatura ambiente durante 5 min para eliminar completamente el etanol residual.

9. El kit se utilizó incorrectamente.

Sugerencia: para muestras de plantas de polisacáridos polifenólicos, es posible que no se puedan obtener muestras de ARN ideales si se usan kits comunes como el kit de aislamiento de ARN total de plantas.Le recomendamos que utilice Plant Total RNA IsolationKit Plus, que está especialmente diseñado para muestras de plantas de polisacáridos polifenólicos.Un kit especialmente desarrollado para la extracción de ARN de muestras vegetales de polifenoles y polisacáridos.

El valor OD260/OD280 es bajo

La elución de ARN con ddH2O y utilizada para lecturas de espectrofotómetro da como resultado valores bajos de OD260/OD280.Recomendamos usar Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 (en lugar de ddH2O sin ARNasa para eluir el ARN) para obtener valores de OD260/OD280 relativamente correctos, consulte “Ensayos de concentración y purificación de ARN” en la página 19.

El ARN purificado se degrada

La calidad del ARN purificado está relacionada con factores como la conservación de la muestra, la contaminación por ARNasa y la manipulación.

Análisis de causas comunes:

1. Las muestras de tejido no se almacenaron a tiempo después de la recolección.

Recomendación: si las muestras de tejido no se usan a tiempo después de la recolección, guárdelas en nitrógeno líquido a baja temperatura inmediatamente o transfiéralas a -80 °C para almacenamiento a largo plazo después de congelarlas rápidamente en nitrógeno líquido, o sumerja inmediatamente las muestras en una solución estabilizadora de ARN RNAlater (muestras de animales).Para la extracción de ARN, intente utilizar muestras de tejido recién recolectadas.

2. Congelación y descongelación repetida de muestras de tejido.

Sugerencia: cuando almacene muestras de tejido, es mejor cortarlas en pedazos pequeños para su conservación y sacar una parte de ellos cuando los use para evitar la degradación del ARN causada por la congelación y descongelación repetidas de las muestras.

3. Se introduce ARNasa en el quirófano o no se utilizan guantes desechables, mascarillas, etc.

Sugerencia: los experimentos de extracción de ARN se realizan mejor en operaciones de ARN separadas, y la mesa del laboratorio debe limpiarse antes del experimento, y deben usarse guantes y máscaras desechables durante el experimento para evitar la degradación del ARN causada por la introducción de RNasa en la mayor medida posible.

4.El reactivo está contaminado por RNase durante el uso.

Sugerencia: reemplazar con una nueva serie de kits de extracción de ARN total de plantas para experimentos relacionados.

5. Los tubos de centrífuga y las puntas de pipeta que se utilizan para manipular el ARN están contaminados con ARNasa.

Sugerencia: asegúrese de que los tubos de centrífuga, las puntas de las pipetas, las pipetas, etc. que se utilizan en la extracción de ARN no contengan ARNasa.

Manuales de instrucciones:

Plant Total RNA Isolation Kit Plus Manual de instrucciones