Esterilización de puntas de pipeta y tubos EP, etc.
1. Prepare DEPC (sustancia altamente tóxica) al 0,1 % (una milésima) con agua desionizada, utilícelo con cuidado en una campana extractora y guárdelo a 4 °C protegido de la luz;
El agua DEPC es agua pura tratada con DEPC y esterilizada a alta temperatura y alta presión.Probado para estar libre de RNasa, DNasa y proteinasa.
2. Coloque la punta de pipeta y el tubo EP en DEPC al 0,1 % y asegúrese de que la punta de la pipeta y el tubo EP estén llenos con DEP al 0,1 %.
3. Proteger de la luz, dejar reposar toda la noche (12-24h)
4. La caja que contiene la punta y el tubo EP no necesita remojarse en DEPC.Después de eliminar aproximadamente el agua DEPC en la punta o el tubo EP, empaquételo y envuélvalo.
5. 121 grados centígrados, 30 minutos
6. 180 grados centígrados, seco durante varias horas (al menos 3 horas)
No hay té.¡Use guantes y máscaras de látex cuando manipule DEPC!b, o sin esterilización DEPC, 130 ℃, autoclave de 90 minutos (muchos laboratorios esterilizan dos veces a alta temperatura)
Consideraciones de extracción de ARN
Dos fenómenos principales de falla en el aislamiento del ARN tisular
Degradación del ARN y residuos de impurezas en los tejidos,En cuanto a la degradación, veamos primero por qué el ARN extraído de células cultivadas no se degrada fácilmente.Todos los reactivos de extracción de ARN existentes contienen componentes que inhiben rápidamente la ARNasa.Agregue el lisado a las células cultivadas y simplemente mézclelo, todas las células se pueden mezclar completamente con el lisado y las células se lisan por completo.Después de lisar las células, los ingredientes activos del lisado inhiben inmediatamente la RNasa intracelular, por lo que el ARN permanece intacto.Es decir, debido a que las células cultivadas se ponen en contacto fácil y completamente con el lisado, su ARN no se degrada fácilmente;por otro lado, el ARN en el tejido se degrada fácilmente porque las células en el tejido no son fáciles de contactar rápidamente con el lisado.debido al contacto suficiente.Entonces,suponiendo que haya una manera de convertir el tejido en una sola célula mientras se inhibe la actividad del ARN, el problema de la degradación podría resolverse por completo.
La molienda con nitrógeno líquido es el método más efectivo.Sin embargo, el método de molienda con nitrógeno líquido es muy problemático, especialmente cuando el número de muestras es grande.Esto dio lugar a la siguiente mejor opción: el homogeneizador.ElhomogeneizadorEl método no considera la cuestión de cómo se inhibe la actividad de la RNasa antes de que las células entren en contacto con el lisado, sino que reza para que la tasa de alteración del tejido sea más rápida que la tasa a la que la RNasa intracelular degrada la RN.
El efecto del homogeneizador eléctrico es mejor,y el efecto del homogeneizador de vidrio es pobre, pero en general, el método del homogeneizador no puede prevenir el fenómeno de degradación.Por lo tanto, si se degrada la extracción, se debe utilizar el homogeneizador eléctrico original para la molienda con nitrógeno líquido;el homogeneizador de vidrio original debe cambiarse a un homogeneizador eléctrico o moler directamente con nitrógeno líquido.El problema es casi 100% factible.resolverse
El problema de los residuos de impurezas que afectan a los experimentos posteriores tiene causas más diversas que la degradación y, en consecuencia, las soluciones son diferentes.En conclusión,si hay degradación o impurezas residuales en el tejido, se debe optimizar el método/reactivo de extracción para el material experimental específico.No tiene que usar sus preciosas muestras para la optimización: puede comprar algunos animales pequeños como pescado/pollo en el mercado, tomar la parte correspondiente del material para la extracción de ARN y la otra parte para la extracción de proteínas: moler con extracto de boca, estómago e intestinos.
El ARN objetivo del ARN extraído se utiliza para diferentes experimentos de seguimiento y sus requisitos de calidad son diferentes.
La construcción de la biblioteca de ADNc requiere la integridad del ARN sin residuos de inhibidores de la reacción enzimática;Northern requiere una mayor integridad del ARN y menores requisitos de residuos de inhibidores de la reacción enzimática;RT-PCR no requiere una integridad de ARN demasiado alta,pero inhibe las reacciones enzimáticas.Los requisitos de residuos son estrictos.La entrada determina la salida;cada vez que el objetivo es obtener el ARN de mayor pureza, costará dinero y personas.
Recolección/Almacenamiento de Muestras
Factores que afectan la degradación Después de que la muestra abandona el cuerpo vivo o el entorno de crecimiento original, las enzimas endógenas de la muestra comenzarán a degradar el ARN,y la tasa de degradación está relacionada con el contenido de enzimas endógenas y la temperatura.Tradicionalmente, solo hay dos formas de inhibir por completo la actividad enzimática endógena: agregar lisado inmediatamente y homogeneizar completa y rápidamente;Cortar en trozos pequeños e inmediatamente congelar en nitrógeno líquido.Ambos enfoques requieren una operación rápida.Este último es apto para todas las muestras, mientras que el primero sólo es apto para tejidos con bajo contenido de células y enzimas endógenas y más fáciles de homogeneizar.Específicamente, el tejido vegetal, el hígado, el timo, el páncreas, el bazo, el cerebro, la grasa, el tejido muscular, etc. se congelan mejor con nitrógeno líquido antes de continuar.
Fragmentación y homogeneización de muestras
Factores que afectan la degradación y el rendimiento La fragmentación de la muestra espara una homogeneización completa, que es para la liberación completa y completa de ARN.Las células se pueden homogeneizar directamente sin que se rompan.Los tejidos pueden homogeneizarse solo después de romperse.La levadura y las bacterias deben romperse con las enzimas correspondientes antes de que puedan homogeneizarse.Los tejidos con un contenido enzimático endógeno más bajo y una homogeneización más fácil se pueden triturar y homogeneizar al mismo tiempo en el lisado mediante un homogeneizador;tejido vegetal, hígado, timo, páncreas, bazo, cerebro, grasa, tejido muscular y otras muestras, tienen un alto contenido de enzimas endógenas o no se homogeneizan fácilmente,por lo tanto, la disrupción y la homogeneización del tejido deben realizarse por separado.El método de fragmentación más confiable y productivo es la molienda con nitrógeno líquido, y el método de homogeneización más confiable es el uso de un homogeneizador eléctrico.Una nota especial sobre la molienda con nitrógeno líquido: la muestra no debe descongelarse durante todo el proceso de molienda, ya que es más probable que las enzimas endógenas funcionen cuando se congelan.
Elección de lisado
Afectando la conveniencia de la operación y los factores de impurezas endógenas residuales Las soluciones de lisis de uso común casi pueden inhibir la actividad de la RNasa.Por lo tanto, el punto clave de elegir una solución de lisis es considerarla en combinación con el método de purificación.Hay una excepción:Se recomienda que las muestras con un alto contenido de enzimas endógenas utilicen un lisado que contenga fenol para aumentar la capacidad de inactivar las enzimas endógenas.
Elección del método de purificación
Factores que afectan las impurezas endógenas residuales, la velocidad de extracción Para muestras limpias como las células, se pueden obtener resultados satisfactorios con casi cualquier método de purificación disponible.Pero para muchas otras muestras, especialmente aquellas con altos niveles de impurezas como plantas, hígado, bacterias, etc., es crucial elegir un método de purificación adecuado.El método de purificación centrífuga de columna tiene una velocidad de extracción rápida y puede eliminar eficazmente las impurezas que afectan la reacción enzimática posterior del ARN, pero es costoso (Foregene puede ofrecer kits rentables, haga clic en más detallesaquí);El uso de métodos de purificación clásicos y económicos, como la precipitación con LiCl, también puede obtener resultados satisfactorios, pero el tiempo de operación es largo..
“Tres Disciplinas y Ocho Atenciones” para la Extracción de ARN
Disciplina 1:Poner fin a la contaminación de enzimas exógenas.
Nota 1:Usar estrictamente máscaras y guantes.
Nota 2:Los tubos de centrífuga, los cabezales de las puntas, las varillas de las pipetas, los tanques de electroforesis y los bancos experimentales que intervienen en el experimento deben desecharse completamente.
Nota 3:Los reactivos/soluciones involucrados en el experimento, especialmente el agua, deben estar libres de ARNasa.
Disciplina 2:Bloquear la actividad de las enzimas endógenas
Nota 4:Elija un método de homogeneización apropiado.
Nota 5:Elija un lisado apropiado.
Nota 6:Controle la cantidad inicial de la muestra.
Disciplina 3:Aclare su propósito de extracción
Nota 7:Con cualquier sistema de lisado que se acerque a la cantidad inicial máxima de muestra, la tasa de éxito de la extracción cae bruscamente.
Nota 8:El único criterio económico para la extracción exitosa de ARN es el éxito en experimentos posteriores, no el rendimiento.
Las 10 principales fuentes de contaminación por ARNasa
1. Los dedos son la primera fuente de enzimas exógenas, por lo que los guantes deben usarse y reemplazarse con frecuencia.Además, también se deben usar máscaras, porque la respiración también es una fuente importante de enzimas.Un beneficio adicional de usar una máscara con guantes es proteger al experimentador.
2. Puntas de pipeta, tubos de centrífuga, pipetas: la RNasa no se puede inactivar solo con la esterilización, por lo que las puntas de pipeta y los tubos de centrífuga deben tratarse con DEPC, incluso si están marcados como tratados con DEPC.Lo mejor es usar una pipeta especial, limpiarla con un algodón con alcohol al 75% antes de usarla, especialmente la varilla;además, asegúrese de no usar un removedor de cabeza.
3. El agua/tampón debe estar libre de contaminación por ARNasa.
4. Al menos la mesa de prueba debe limpiarse con bolas de algodón con alcohol al 75 %.
5. ARNasa endógena Todos los tejidos contienen enzimas endógenas, por lo que la congelación rápida de tejidos con nitrógeno líquido es la mejor manera de reducir la degradación.El método de trituración/almacenamiento de nitrógeno líquido es ciertamente inconveniente, pero es la única forma para tejidos con altos niveles de enzimas endógenas.
6. Muestras de ARN Los productos de extracción de ARN pueden contener trazas de contaminación por ARNasa.
7. Extracción de plásmidos La extracción de plásmidos a menudo utiliza Rnasa para degradar el ARN, y la Rnasa residual debe digerirse con Proteinasa K y extraerse mediante PCI.
8. Almacenamiento de ARN Incluso si se almacena a baja temperatura, pequeñas cantidades de RNasa provocarán la degradación del ARN.La mejor solución para la conservación a largo plazo del ARN es una suspensión de sal/alcohol, porque el alcohol inhibe toda la actividad enzimática a bajas temperaturas.
9. Cuando los cationes (Ca, Mg) contienen estos iones, el calentamiento a 80 °C durante 5 minutos hará que el ARN se escinda, por lo que si es necesario calentar el ARN, la solución de conservación debe contener un agente quelante (citrato de sodio 1 mM, pH 6,4).
10. Las enzimas utilizadas en experimentos posteriores pueden estar contaminadas con RNasa.
10 consejos para la extracción de ARN
1: previene rápidamente la actividad de la RNasa.Las muestras se congelan rápidamente después de la recolección y la RNasa se inactiva mediante una operación rápida durante la lisis.
2: Elija un método de extracción apropiado para tejido con alto contenido de ribozima, y el tejido adiposo es mejor para usar el método que contiene fenol.
3: La calidad de predicción requiere Northern, la construcción de bibliotecas de cDNA requiere alta integridad, y RT-PCR y RPA (ensayo de protección de ribonucleasa) no requieren alta integridad.RT-PCR requiere alta pureza (residuos de inhibidores de enzimas).
4: La homogeneización completa es la clave para mejorar el rendimiento y reducir la degradación.
5: compruebe la integridad de la detección de electroforesis de ARN, 28S: 18S = 2: 1 es un signo completo, 1: 1 también es aceptable para la mayoría de los experimentos.
6: Eliminación de ADN para RT-PCR, análisis de matriz Lo mejor es usar Dnase I para eliminar el ADN.
7: Reducir la contaminación de enzimas exógenas: las enzimas no se pueden importar del exterior.
8: Al concentrar ácido nucleico de baja concentración, se debe agregar un reactivo de coprecipitación.Pero para evitar que el coprecipitante contenga enzimas y contaminación del ADN.
9: Disuelva completamente el ARN, si es necesario, caliente a 65C durante 5 minutos.
método de almacenamiento adecuado
Se puede almacenar a –20C por un corto tiempo y a –80C por mucho tiempo.El primer paso para mejorar los rendimientos de ARN es darse cuenta de que el contenido de ARN de diferentes muestras varía mucho.Alta abundancia (2-4 ug/mg) como hígado, páncreas, corazón, abundancia media (0,05-2 ug/mg) como cerebro, embrión, riñón, pulmón, timo, ovario, baja abundancia (<0,05 ug/mg) mg) como vejiga, hueso, grasa.
1: lisar las células para liberar RN: si no se libera el ARN, se reducirá el rendimiento.La homogeneización eléctrica funciona mejor que otros métodos de homogeneización, pero es posible que también deba combinarse con otros métodos, como la maceración con nitrógeno líquido, la digestión enzimática (lisozima/liticasa)
2: Optimización del método de extracción.Los mayores problemas con los métodos basados en fenol son la estratificación incompleta y la pérdida parcial de ARN (el sobrenadante no se puede eliminar por completo).La estratificación incompleta se debe al alto contenido de ácidos nucleicos y proteínas, que se puede solucionar aumentando la cantidad de lisado utilizado o reduciendo la cantidad de muestra.Se añadió un paso de extracción de cloroformo al tejido adiposo.La pérdida de ARN se puede reducir con un retrobombeo o eliminando la capa orgánica seguida de centrifugación.El mayor problema con los métodos basados en centrifugación en columna es el exceso de muestra.
Consejos de extracción clásicos
1. Purificación de fenol: agregue un volumen igual de fenol/cloroformo 1:1 y mezcle vigorosamente durante 1-2 minutos.Centrifugar a alta velocidad durante 2 minutos.Retire con cuidado el sobrenadante (80-90%).Nunca llegues a la capa intermedia.Se puede agregar un volumen igual de la solución de reacción a Fenol/Cloroformo y eliminar el sobrenadante.Los dos sobrenadantes se pueden mezclar para la precipitación de ácidos nucleicos para mejorar el rendimiento.No sea demasiado suave al mezclar y no intente eliminar todo el sobrenadante.
2. Lavado con etanol al 70-80 %: durante el lavado, el ácido nucleico debe suspenderse para garantizar que la sal residual se elimine por lavado.Al mismo tiempo, inmediatamente después de verter el etanol, centrifugue a alta velocidad durante unos segundos y luego retire el etanol residual con una pipeta.Disolver después de reposar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
11. Extracción de organizaciones especiales
1. Tejido fibroso: la clave para la extracción de ARN del tejido fibroso, como el corazón o el músculo esquelético, es romper completamente el tejido.Estos tejidos tienen una densidad celular baja, por lo que la cantidad de ARN por unidad de peso de tejido es baja y es mejor usar la mayor cantidad posible de partida.Asegúrese de moler bien el tejido en condiciones de congelación.
2. Tejidos con alto contenido de proteínas/grasas: el cerebro/contenido de grasas vegetales es alto.Después de la extracción PCI, el sobrenadante contiene flóculos blancos.El sobrenadante debe volver a extraerse con cloroformo.
3. Tejidos con alto contenido de ácido nucleico/ribozima: el bazo/timo tiene un alto contenido de ácido nucleico y ribozima.Triturar el tejido en condiciones de congelación seguido de una rápida homogeneización puede inactivar eficazmente las ribozimas.Sin embargo, si el lisado es demasiado viscoso (debido al alto contenido de ácido nucleico), la extracción PCI no podrá estratificarse de manera efectiva;agregar más lisado puede resolver este problema.Múltiples extracciones de PCI pueden eliminar más ADN residual.Si se forma un precipitado blanco inmediatamente después de agregar alcohol, indica contaminación de ADN.La reextracción con PCI ácida después de la disolución puede eliminar la contaminación del ADN.
4. Tejido vegetal: El tejido vegetal es más complejo que el tejido animal.Generalmente, las plantas se muelen en condiciones de nitrógeno líquido, por lo que la degradación del ARN por enzimas endógenas es poco común.Si el problema de degradación no se resuelve, es casi seguro que se deba a las impurezas contenidas en la muestra.Las impurezas contenidas en muchas plantas darán lugar a residuos, y la razón de los residuos a menudo se debe a que estas impurezas tienen algunas similitudes con el ARN: tú precipitas y yo precipito, y tú adsorbes y yo adsorbo.Estas características determinan que sean inhibidores enzimáticos muy fuertes.
En la actualidad, los reactivos comerciales de extracción de ARN se pueden adaptar a casi todos los tejidos animales con pequeños ajustes, pero hay pocos reactivos comerciales de extracción de ARN que puedan ser adecuados para la mayoría de los tejidos vegetales.Afortunadamente, Foregene puede proporcionar servicios especialeskits de extracción de ARN de plantas, tenemosKit de aislamiento de ARN total de plantas, Kit de aislamiento de ARN total de plantas Plus.Este último está especialmente diseñado para plantas con alto contenido en polisacáridos y polifenoles.Para la extracción de ARN, los comentarios de los usuarios del laboratorio son particularmente buenos.
12. El efecto de la congelación y descongelación de la muestra La muestra congelada puede ser más grande y debe cortarse antes de usarse para la extracción de ARN.Las muestras tienden a derretirse (posiblemente parcialmente) durante el corte.Es posible que sea necesario pesar las muestras congeladas antes de la extracción de ARN, y definitivamente se descongelará durante este proceso.A veces, la descongelación de la muestra también se produce durante el proceso de molienda con nitrógeno líquido;o la muestra congelada se agrega directamente al lisado sin molienda con nitrógeno líquido, y la descongelación definitivamente ocurrirá antes de la homogeneización completa.Los experimentos han demostrado que el tejido congelado es más propenso a la degradación del ARN durante la descongelación que el tejido fresco.La razón probable: el proceso de congelación y descongelación altera las estructuras dentro de la célula, lo que facilita que las enzimas endógenas entren en contacto directo con el ARN.
13. Evaluación de la calidad del ARN Por lo general, la electroforesis se utiliza para evaluar la integridad del ARN y A260/A280 para evaluar la pureza del ARN.En teoría, el ARN intacto tiene una proporción de 28S:18S = 2,7:1 y la mayoría de los datos enfatizan la proporción de 28S:18S = 2:1.El hecho es que casi nada del ARN extraído de muestras que no sean células está en una proporción de 2:1 (esto se obtuvo usando el Agilent Bioanalyzer).
Los resultados de la electroforesis del ARN se ven afectados por muchos factores, incluida la estructura secundaria, las condiciones de la electroforesis, la carga de la muestra, el grado de saturación por EB, etc. Use la electroforesis nativa para detectar el ARN y use el marcador de ADN como control.Si el 28S a 2kb y el 18S a 0,9kb son claros y 28S: 18S > 1, la integridad puede cumplir los requisitos de la mayoría de los experimentos posteriores.
A260/A280 es un indicador que ha causado mucha confusión.En primer lugar, es necesario aclarar el significado original de este indicador de ácidos nucleicos: ARN puro, su A260/280 = alrededor de 2,0.El ARN puro es la 'causa' y A260/A280 = 2 es el 'efecto'.Ahora todos usan A260/A280 como 'causa', pensando que "si A260/A280 = 2, entonces el ARN es puro", lo que naturalmente genera confusión.
Si está interesado, puede agregar un pequeño reactivo que se usa a menudo en la extracción, como fenol, isotiocianato de guanidina, PEG, etc., a su muestra de ARN y luego medir la relación A260/A280.La realidad es que muchos de los reactivos utilizados para la extracción de ARN, así como muchas impurezas en la muestra, absorben alrededor de A260 y A280, afectando a A260/A280.
El enfoque más instructivo en la actualidad es escanear muestras de ARN en el rango de 200-300 nm.La curva de ARN puro tiene las siguientes características: la curva es suave, A230 y A260 son dos puntos de inflexión, A300 está cerca de 0, A260/A280 = alrededor de 2,0 y A260/A230 = alrededor de 2,0.Si los datos de escaneo no están disponibles, también se debe determinar la relación A260/A230, ya que esta relación es más sensible al arrastre de todas las impurezas que afectan la reacción enzimática.Tenga en cuenta el rango lineal del dispositivo (0,1–0,5 para A260).
Hay otros dos fenómenos útiles: la relación será aproximadamente 0,3 más baja cuando se mida A260/A280 en agua;mientras que la proporción medida en EDTA 10 mM es aproximadamente 0,2 superior a la medida en EDTA 1 mM.
Productos relacionados:
Serie de aislamiento de ARN – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Hora de publicación: 15-jul-2022
