El experimento RT-qPCR incluye extracción de ARN y evaluación de calidad, transcripción inversa y qPCR en tres pasos, cada paso tiene muchas precauciones, las presentaremos en detalle a continuación.

Ⅰ.Evaluación de la calidad del ARN

En el experimento RT-qPCR, después de completar la extracción de ARN, se debe evaluar la calidad del ARN y el experimento de seguimiento solo se puede llevar a cabo después de que esté calificado.Los métodos de evaluación incluyen espectrofotómetro, electroforesis en gel Agilent, análisis Agilent 2100, entre los que se encuentran el espectrofotómetro más utilizado y el método de detección por electroforesis en gel de agarosa.Cabe señalar que estos dos métodos deben usarse juntos para completar la detección y el análisis de la concentración, pureza e integridad del ARN, a fin de garantizar la calidad del ARN.

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Espectrofotómetro:

El espectrofotómetro se utiliza principalmente para determinar la concentración y la pureza del ARN, pero no puede detectar la integridad del ARN y los residuos genómicos.Entre ellos, A260/280 y A260/230 son parámetros importantes para la detección de la pureza del ARN, y la pureza del ARN se puede detectar según la fluctuación de sus valores:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, lo que indica que la pureza del ARN es buena;A260/280<1,9, lo que indica que puede haber un residuo de proteína en el ARN;A260/280>2.1, lo que indica una posible degradación parcial del ARN, que puede confirmarse aún más mediante electroforesis en gel de agarosa.

2. 2,0< A260/230< 2,2, lo que indica que la pureza del ARN es buena;A260/230< 2,0, lo que indica que puede haber residuos de reactivos orgánicos en el ARN, como fenoles, etanol o azúcares.

Electroforesis en gel de agarosa:

El ensayo de electroforesis en gel de agarosa puede analizar la integridad del ARN, el genoma y los residuos de proteínas, pero no puede cuantificar con precisión la concentración de ARN ni detectar los residuos de los reactivos orgánicos.Tome las plantillas de ARN eucariótico, por ejemplo:

1. El ARN se sometió a electroforesis en gel de agarosa.Si solo había tres bandas individuales de 28sRNA, 18sRNA y 5.8sRNA en el mapa de gel, indica que el RNA extraído está intacto.Si hay un fenómeno de arrastre, indica una degradación parcial del ARN.

2. Si hay una sola banda brillante entre el orificio de pegamento y la banda de 28sRNA, puede haber residuos de ADN genómico.

3. Si aparecen bandas en el orificio del pegamento, indica que puede haber residuos de proteínas y otras sustancias macromoleculares.

Ⅱ. Transcripción inversa

Una vez completada la extracción de ARN, debe invertirse en ADNc para experimentos posteriores, por lo que el paso de inversión es esencial.La transcripción inversa se introducirá a partir de la selección de la transcriptasa inversa y el cebador:

Selección de transcriptasa inversa:

Las transcriptasas inversas típicas incluyen AMV RTase y MMLV RTase.La RNasa H de AMV RTasa tiene una fuerte actividad, una duración de síntesis corta, una cantidad de síntesis baja y una buena estabilidad térmica (42 ~ 55 ℃).La actividad de RNase H de MMLV RTase es débil, la duración de la síntesis es larga, la cantidad de síntesis es alta y la estabilidad térmica es deficiente (37 ~ 42 ℃).

Debido a que la enzima RNasa H tiene la función de degradar la plantilla de ARN, MMLV con actividad débil de RNasa H debe seleccionarse preferentemente durante la transcripción inversa y, después de la ingeniería genética posterior, la estabilidad térmica de MMLV ha alcanzado un salto cualitativo.tomando foregeneTranscriptasa inversa Foreasy (M-MLV para transcripción inversa) como ejemplo, es una nueva transcriptasa inversa expresada en bacterias modificadas con E. coli utilizando tecnología de recombinación genética.Es una polimerasa de ADN recombinante que sintetiza una cadena de ADN complementaria a partir de ARN monocatenario, ADN o un híbrido ARN:ADN.No tiene actividad de RNasa H, fuerte estabilidad, fuerte afinidad por ARN y alta sensibilidad de detección.

 

Transcriptasa inversa Foreasy (M-MLV para transcripción inversa)

Selección de imprimación:

Generalmente, los cebadores de RT se dividen en tres categorías: oligo dT, cebadores aleatorios y cebadores específicos de genes.Seleccione los cebadores adecuados para su uso de acuerdo con los diferentes requisitos experimentales.

1. Si la plantilla es de origen eucariótico y el ADNc tardío se utiliza para la amplificación por PCR de rutina, se recomienda Oligo (dT);Si el experimento posterior solo se usa para qPCR, se recomienda mezclar Oligo (dT) con cebadores aleatorios para mejorar la eficiencia de la transcripción inversa.

2. Si la plantilla proviene de procariotas, se deben seleccionar cebadores aleatorios o cebadores específicos de genes para la transcripción inversa.

Ⅲ.qPCR

La cuantificación de fluorescencia se elabora principalmente a partir de la selección de métodos cuantitativos, principios de diseño de cebadores, selección de ROX, configuración del sistema de reacción y establecimiento de condiciones de reacción, etc.

Selección de métodos cuantitativos:

Los métodos cuantitativos se dividen en métodos cuantitativos relativos y métodos cuantitativos absolutos.La cuantificación relativa se puede utilizar para detectar el efecto de ciertos métodos de tratamiento en la expresión génica, detectar la diferencia de expresión génica en diferentes momentos y comparar la diferencia de expresión génica en diferentes tejidos.La cuantificación absoluta puede detectar la cantidad de ácido nucleico en el virus y así sucesivamente.Al hacer experimentos, debemos elegir los métodos cuantitativos apropiados de acuerdo con nuestros propios experimentos.

Principios de diseño de imprimación:

El diseño del cebador para qPCR está directamente relacionado con la eficiencia de amplificación y la especificidad del producto.Por lo tanto, diseñar correctamente buenos cebadores es el primer paso de una qPCR exitosa.En el diseño de la imprimación, se debe prestar atención a los siguientes principios al cumplir con el principio del diseño de la imprimación convencional:

1. La longitud del fragmento objetivo se controla entre 100 y 300 pb;

2. Diseño de exón cruzado para evitar la influencia del ADN genómico;

3. Los cebadores diseñados deben probarse para determinar la eficiencia de amplificación, y solo cuando la eficiencia de amplificación alcanza el estándar (90-110 %) pueden usarse para experimentos cuantitativos;

4. La concentración de imprimación suele optimizarse entre 0,1 uM y 1,0 uM.

Selección deROX:

En el proceso de reacción cuantitativa, ROX puede ajustar la diferencia de trayectoria óptica, el error de pipeteo o la diferencia de volumen causada por la evaporación y la condensación de manera uniforme, mejorando la repetibilidad de los resultados.Sin embargo, cabe señalar que la selección de ROX está relacionada con el instrumento.Si el instrumento qPCR tiene la función de corregir automáticamente la diferencia entre agujeros, no necesita agregar ROX;de lo contrario, debe agregar la corrección ROX.Los pequeños socios en la compra de reactivos deben estar de acuerdo con el instrumento utilizado para elegir el ROX correcto, evitar errores posteriores.

Preparación del sistema de reacción:

Se prefieren volúmenes de reacción de 20 ul y 50 ul.Se debe prestar atención a los siguientes aspectos cuando se formula el sistema:

1. El sistema de reacción debe prepararse mediante ventilación en el banco de trabajo ultra limpio, nuevo ddH₂O se usa para cada experimento;

2. Cada experimento necesita preparar NTC para verificar si hay contaminación en el sistema, y ​​cada par de cebadores necesita hacer NTC al preparar el sistema;

3. Para detectar si hay residuos de gDNA en la plantilla de RNA, se puede preparar NRT para cada muestra para detección;

4. Al preparar el sistema, se recomienda hacer al menos 3 repeticiones técnicas para una muestra;

5. Cuando la plantilla es ADNc, se recomienda diluir de 5 a 10 veces para reducir el efecto de inhibición del sistema de transcripción inversa en el experimento qPCR.Es mejor explorar la cantidad de plantilla por gradiente, para que el valor de CT esté entre 20-30;

6. Determine el número requerido de reacciones, aumente en un 5-10% sobre la base del número de reacciones y calcule el número de configuración de volumen;

7, el sistema se prepara utilizando el principio de premezcla, mezcla después de la centrifugación y asegura que no haya burbujas;

8, en la medida de lo posible para elegir consumibles de apoyo.

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