RT-qPCR es el experimento básico de la biología molecular y todo el mundo debe estar familiarizado con él.Incluye principalmente tres pasos: extracción de ARN, transcripción inversa en ADNc y PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real.No ayuda, ¿qué está pasando?Es probable que haya un problema conel experimento de transcripción inversa!Aunque parece que el experimento de transcripción inversa solo necesita agregar ARN, dNTP, cebadores yla transcriptasa inversaal tubo de centrífuga y mezcle bien, pero en el proceso de operación real, todavía hay muchos detalles a los que se debe prestar atención.¡Aprendamos al respecto!

¿Cómo juzgar la calidad del ARN?
¡Para obtener ADNc, la calidad del ARN es fundamental!La calidad del ARN se puede detectar principalmente a partir de dos aspectos:
(1) integridad del ARN:La integridad del ARN se puede verificar mediante electroforesis en gel de agarosa. Tomando los eucariotas como ejemplo, el ARN total completo tiene tres bandas claras, los pesos moleculares de mayor a menor son 28S, 18S y 5S, y 28S es dos veces más brillante que 18S;si se pueden ver tres bandas, pero el tipo de banda es borroso o Difusión significa que el ARN está parcialmente degradado.En este momento, realice la reacción de transcripción inversa de inmediato y aumente la entrada de la plantilla de manera adecuada;si solo se puede ver una banda con un peso molecular pequeño o no se puede ver ninguna banda, el ARN se ha degradado por completo y debe volver a extraerse.Agilent 2100 indica la integridad del ARN con un diagrama de picos y un valor RIN.Si el ácido nucleico está intacto, la línea base del electroferograma es plana;si el ácido nucleico está severamente degradado, la línea de base es irregular y aparecen más picos de degradación;el valor de RIN refleja la integridad del ARN, dentro del rango de 0-10, cuanto mayor sea el valor, mejor será la calidad del ARN.Bueno, cuanto mayor sea el grado de exhaustividad.
(2) Pureza del ARN:La proporción de OD260/280 puede detectarse mediante espectrofotometría UV.Si la proporción de OD260/280 está entre 1,9 y 2,1, la pureza es muy buena.
El ADN genómico residual puede conducir a resultados cuantitativos inexactos
Cuando se extrae el ARN, el ARN que obtenemos puede estar mezclado con ADN genómico (ADNg) que no se ha limpiado.Por lo tanto, el ADNc después de la transcripción inversa también se mezclará conADNg.Durante el descensoqPCRreacción,ADNcy gDNA puede amplificarse simultáneamente, lo que da como resultado un valor de CT relativamente pequeño, por lo que los resultados pueden estar sesgados.
Entonces, ¿qué debemos hacer en esta situación?Foregenesugiere:
(1) Realizar la limpieza del genoma en el ARN invertido, que se puede eliminar mediante extracción en columna durante la extracción de ARN;
(2) Tratar el ARN extraído con ADNasaI , pero termínelo con EDTA;
de reactivos de transcripción inversacon módulos de limpieza del genoma;

¿Cómo elegir cebadores para la transcripción inversa?
Los cebadores de transcripción inversa también afectan el resultado de la reacción de transcripción inversa.Puede elegir cebadores aleatorios, Oligo dT o cebadores específicos de genes para la transcripción inversa según las circunstancias específicas del experimento:
(1) Transcripciones específicas: se recomiendan cebadores específicos de genes;
(2) Transcripciones de fragmentos largos: Se recomiendan cebadores específicos de gen/Oligo dT;
(3) fragmentos internos de transcripciones de segmento largo: cebadores específicos de genes/cebadores aleatorios/cebadores aleatorios + Oligo dT.Si se realiza el experimento posterior de qPCR, Oligo dT no se puede usar solo, porque el uso de Oligo dT solo puede causar un sesgo en el extremo 3 ', lo que lleva a resultados inexactos del experimento de qPCR;
(4) miARN: Se pueden utilizar cebadores Stem-loop o cebadores de cola.

¿Cuántas veces se debe diluir el ADNc del producto de transcripción inversa para la cuantificación?
Después de obtener el ADNc del producto de transcripción inversa, es muy importante cuántas veces se debe diluir el ADNc para los experimentos de qPCR.Si la concentración de ADNc es demasiado alta o demasiado baja, la eficacia de la amplificación puede verse afectada.¿Se puede medir la concentración de ADNc y cómo se debe hacer?
(1) La concentración de ADNc del producto de transcripción inversa no se puede medir porque, además del producto de ADNc, el producto de transcripción inversa también contiene tampón residual de transcripción inversa, transcriptasa inversa, cebadores, etc., que interferirán con los resultados de la medición de la concentración y causarán una proporción anormal de OD260/280, OD260/230 y, por lo tanto, no reflejará el rendimiento real del ADNc.En este momento, dirán algunos amigos, entonces mediré la concentración después de la purificación;Aquí, Foregene quisiera recordar que no se recomienda purificar el ADNc, porque la longitud del ADNc obtenido por la inversión es diferente, y el ADNc corto se perderá en la purificación.
(2) Entonces, ¿qué hacer?Antes del experimento qPCR, el gradiente de dilución del cDNA se puede determinar a través del experimento previo.Por ejemplo: use la solución madre de ADNc, la dilución de 10 veces y la dilución de 100 veces como plantillas para los experimentos de qPCR y seleccione el factor de dilución con un valor de CT en el rango de 18-28.

¿Cómo se deben transcribir de forma inversa los miARN?
El miARN es una molécula pequeña de ARN monocatenario con un tamaño de aproximadamente 22 nt que no codifica proteínas.Debido a su corta longitud, el método qPCR convencional es difícil de cuantificar directamente, por lo que a menudo es necesario extender miRNA;los métodos de transcripción inversa comúnmente utilizados para miARN incluyen el método de bucle de tallo y el método de seguimiento.
El método de bucle de tallo consiste en extender el miARN mediante la adición de cebadores de bucle de tallo.Este método de detección tiene mayor sensibilidad y especificidad, pero el rendimiento de detección es bajo.Una transcripción inversa solo puede detectar un miARN y una referencia interna;el método de adición de colas se compone de dos Se completa con la acción conjunta de dos enzimas, que son la PoliA polimerasa y la transcriptasa inversa.La polimerasa poliA es responsable de agregar colas de poliA al miARN para aumentar su longitud, y la transcriptasa inversa realiza la reacción de transcripción inversa.Este método tiene un alto rendimiento de detección y puede detectar múltiples miARN y referencias internas en una transcripción inversa, pero la sensibilidad y la especificidad son bajas en el método de bucle de tallo.