La PCR cuantitativa por fluorescencia (también conocida como PCR TaqMan, en adelante FQ-PCR) es una nueva tecnología cuantitativa de ácidos nucleicos desarrollada por PE (Perkin Elmer) en los Estados Unidos en 1995. Esta tecnología se basa en la PCR convencional mediante la adición de sondas marcadas con fluorescencia.En comparación con la PCR flexible, la FQ-PCR tiene muchas ventajas para realizar su función cuantitativa.Este artículo pretende describir brevemente las características, principios, métodos y aplicaciones de la tecnología.
1 características
FQ-PCR no solo tiene la alta sensibilidad de la PCR ordinaria, sino que también debido a la aplicación de sondas fluorescentes, puede detectar directamente el cambio de la señal fluorescente durante la amplificación de la PCR a través del sistema de conducción fotoeléctrica para obtener resultados cuantitativos, lo que supera muchas deficiencias de la PCR convencional, por lo que también tiene la alta especificidad de la hibridación del ADN y la alta precisión de la tecnología de espectroscopia.
Por ejemplo, los productos generales de PCR deben observarse mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio con luz ultravioleta o mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata.Esto no solo requiere múltiples instrumentos, sino que también requiere tiempo y esfuerzo.Las tinciones utilizadas con bromuro de etidio son dañinas para el cuerpo humano, y estos complicados procedimientos experimentales brindan oportunidades para la contaminación y los falsos positivos.Sin embargo, FQ-PCR solo necesita abrir la tapa una vez durante la carga de la muestra, y el proceso subsiguiente es una operación de tubo completamente cerrado, que no requiere procesamiento posterior de PCR, lo que evita muchos inconvenientes en las operaciones de PCR convencionales.El experimento generalmente utiliza el termociclador ABI7100 PCR desarrollado por la empresa PE.
El instrumento tiene las siguientes características: ① Amplia aplicación: se puede utilizar para la cuantificación de productos de PCR de ADN y ARN, investigación de expresión génica, detección de patógenos y optimización de las condiciones de PCR.② Principio cuantitativo único: al usar sondas marcadas con fluorescencia, la cantidad de fluorescencia se acumulará con el ciclo de PCR después de la excitación con láser, para lograr el propósito de la cuantificación.③ Alta eficiencia de trabajo: termociclador PCR 9600 incorporado, controlado por computadora de 1 a 2 horas para completar la amplificación y cuantificación de 96 muestras de forma automática y sincrónica.④ Sin necesidad de electroforesis en gel: no es necesario diluir y electroforesis la muestra, solo use una sonda especial para detectar directamente en el tubo de reacción.⑤ Sin contaminación en la tubería: se adoptan el exclusivo tubo de reacción completamente cerrado y el sistema de conducción fotoeléctrica, por lo que no hay necesidad de preocuparse por la contaminación.⑥Los resultados son reproducibles: el rango dinámico cuantitativo es de hasta cinco órdenes de magnitud.Por lo tanto, desde que esta tecnología se desarrolló con éxito, ha sido valorada por muchos investigadores científicos y se ha aplicado en muchos campos.
2 Principios y métodos
El principio de funcionamiento de FQ-PCR es utilizar la actividad de exonucleasa 5′→3′ de la enzima Taq para agregar una sonda marcada con fluorescencia al sistema de reacción de PCR.La sonda puede hibridarse específicamente con la plantilla de ADN contenida en la secuencia del cebador.El extremo 5′ de la sonda está marcado con el gen de emisión de fluorescencia FAM (6-carboxifluoresceína, pico de emisión de fluorescencia a 518 nm), y el extremo 3′ está marcado con el grupo de extinción de fluorescencia TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina, pico de emisión de fluorescencia a 582 nm), el comienzo 3′ de la sonda está fosforilado para evitar que la sonda se alargue durante la amplificación por PCR.Cuando la sonda permanece intacta, el grupo extintor suprime la emisión de fluorescencia del grupo emisor.Una vez que el grupo emisor se separa del grupo extintor, se levanta la inhibición y la densidad óptica a 518 nm aumenta y es detectada por el sistema de detección de fluorescencia. En la fase de renaturalización, la sonda se hibrida con la plantilla de ADN y la enzima Taq en la fase de extensión se mueve a lo largo de la plantilla de ADN con la extensión del cebador.Cuando se corta la sonda, se libera el efecto de extinción y se libera la señal fluorescente.Cada vez que se copia la plantilla, se corta una sonda, acompañada de la liberación de una señal fluorescente.Dado que existe una relación de uno a uno entre el número de fluoróforos liberados y el número de productos de PCR, esta técnica se puede utilizar para cuantificar con precisión la plantilla.El instrumento experimental generalmente usa el termociclador ABI7100 PCR desarrollado por la empresa PE, y también se pueden usar otros termocicladores.Si se utiliza el sistema de reacción del tipo de reacción ABI7700 para el experimento, una vez completada la reacción, los resultados cuantitativos se pueden obtener directamente a través del análisis por computadora.Si usa otros termocicladores, necesita usar un detector de fluorescencia para medir la señal de fluorescencia en el tubo de reacción al mismo tiempo para calcular RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ representa la relación entre la intensidad de luminiscencia del grupo de emisión fluorescente del tubo de muestra y la intensidad de luminiscencia del grupo de extinción, RQ- representa la relación de los dos en el tubo en blanco, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) representa la cantidad de cambio de la señal de fluorescencia durante la PCR Después del procesamiento de datos, se pueden obtener resultados cuantitativos.Debido a la introducción de sondas fluorescentes, la especificidad del experimento mejora significativamente.Por lo general, el diseño de la sonda debe cumplir las siguientes condiciones: ①La longitud de la sonda debe ser de aproximadamente 20 a 40 bases para garantizar la especificidad de la unión.②El contenido de bases GC está entre el 40 % y el 60 % para evitar la duplicación de secuencias de nucleótidos individuales.③ Evite la hibridación o la superposición con los cebadores.④ La estabilidad de la unión entre la sonda y la plantilla es mayor que la estabilidad de la unión entre el cebador y la plantilla, por lo que el valor de Tm de la sonda debe ser al menos 5 °C más alto que el valor de Tm del cebador.Además, la concentración de la sonda, la homología entre la secuencia de la sonda y la plantilla, y la distancia entre la sonda y el cebador tienen un impacto en los resultados experimentales.
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Hora de publicación: 15-oct-2021
