Las transcriptasas inversas tradicionales no pueden tolerar altas temperaturas (la temperatura óptima para la actividad de MMLV es de 37 a 50 °C y AMV es de 42 a 60 °C).El ARN viral más complejo no se puede transcribir de manera inversa de manera efectiva en ADNc a bajas temperaturas, lo que resulta en una eficiencia de detección La reducción.La RT-qPCR tradicional generalmente requiere la participación de dos enzimas clave (transcriptasa inversa y ADN polimerasa), lo que hace que sea imposible simplificar la operación del sistema de reacción y reducir el costo.Aquí presentaremos dos transcriptasas inversas resistentes a altas temperaturas, TtH y RevTaq.Estas dos enzimas también tienen la función de ADN polimerasa, por lo que se denominan enzimas bifuncionales.

TtH ADN polimerasa

Debes haber oído hablar de la TtH, que se deriva de la bacteria termófila Thermus thermophilus HB8.En presencia de cationes divalentes como Mg2+, tiene actividad de ADN polimerasa.Se usa ampliamente en reacciones de PCR como la enzima Taq, pero tiene una mayor resistencia al calor que la enzima Taq, por lo que también tiene un mejor efecto en la PCR con plantillas de alto contenido de GC.

· Esta enzima básicamente no tiene actividad de exonucleasa 3′→5′ y actividad de exonucleasa 5′→3′, por lo que también se puede utilizar para la secuenciación didesoxi.

· Esta enzima tiene actividad RTasa.En presencia de Mn2+, se potenciará la actividad de la RTasa.Con esta característica, se puede usar para realizar una reacción de transcripción inversa y una reacción de PCR en el mismo tubo, es decir, RT-PCR de un solo paso.Sin embargo, en presencia de Mn2+, la precisión de la RT-PCR no es alta.La actividad de RT no tiene nada que ver con la actividad de la rnaasa H.

· El aumento de la actividad de la polimerasa Tth-DNA (pH9, óptimo +55 ℃ ~ +70 ℃, máximo +95 ℃) supera los problemas causados ​​por la estructura secundaria del ARN.El ADNc resultante se puede amplificar mediante PCR con la misma enzima en presencia de iones Mg2+.

· La capacidad de la Tth-ADN polimerasa para realizar la transcripción inversa y la amplificación del ADN a altas temperaturas hace que esta enzima sea útil para la RT-PCR cuantitativa, la clonación y el análisis de la expresión génica del ARN celular y viral.
· Tth-DNA polimerasa se utiliza para RT-PCR para amplificar el ARN hasta 1 kb.

Características y ventajas

Tth ADN polimerasa:

• Asegurar el tamaño optimizado del producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos 1000 pb en la reacción de RT-PCR

• Aceptar trifosfato de desoxirribonucleósido modificado como sustrato

• No relacionado con la actividad de la RNasa H

• Tiene alta estabilidad térmica para superar problemas, generalmente relacionados con la alta estructura secundaria presente en el ARN

ADN polimerasa RevTaq RT-PCR

Una polimerasa de ADN resistente al calor con actividad de transcriptasa inversa

RevTaq-RT-PCR-DNA polimerasa es una enzima diseñada, altamente resistente al calor y de doble función con actividades de transcriptasa inversa y ADN polimerasa obtenida a través de evolución artificial y dirigida.

· La vida media de la ADN polimerasa RevTaq RT-PCR a 95 °C es superior a 40 minutos.

· La polimerasa de ADN RevTaq RT-PCR permite la transcripción inversa a alta temperatura directamente desde la plantilla de ARN, y el paso de transcripción inversa se puede repetir varias veces para generar más plantillas de ADNc.

· La ADN polimerasa RevTaq RT-PCR permite la RT-PCR de "paso cero" (sin paso de transcripción inversa isotérmica), porque en el paso de extensión de la PCR cíclica, la transcripción inversa y la amplificación del ADN ocurren simultáneamente.Esto también promueve la reacción de transcripción inversa a altas temperaturas, minimizando así los problemas encontrados al fundir la fuerte estructura secundaria en el ARN a altas temperaturas.

· Debido a la fórmula de inicio en caliente basada en aptámeros, la ADN polimerasa RevTaq RT-PCR producirá mejores resultados cuando la temperatura de hibridación y extensión sea superior a 57 °C.

· Dado que la enzima es resistente al calor, se recomienda diseñar cebadores y sondas con puntos de fusión muy altos (>60°C).

· Se recomienda optimizar la temperatura del paso de recocido/extensión a través de un gradiente de temperatura durante el proceso de preparación de la reacción.

· A mayor temperatura, mayor especificidad de la PCR.El ciclo de transcripción inversa generalmente se realiza a una temperatura más alta que el ciclo de PCR, porque la hibridación Cebador de ADN: Plantilla de ARN generalmente tiene un punto de fusión más alto que el dúplex Cebador de ADN: Plantilla de ADNc.

· La polimerasa de ADN RevTaq RT-PCR está diseñada y optimizada genéticamente, y el tamaño del amplicón es de entre 60 y 300 pb.

El límite de detección de la ADN polimerasa RevTaq RT-PCR alcanza las 4 copias/

El sistema de reacción optimizado (el establecimiento de cebadores de alto punto de fusión) se muestra en la figura.RevTaq RT-PCR La RT-PCR basada en polimerasa de ADN muestra una mejor sensibilidad que la mezcla maestra de RT-qPCR de 1 paso TaqPath y una detección más baja Gradiente de dilución de la muestra.

Más ventajas:

Función de inicio rápido → El paso inicial de desnaturalización térmica se puede omitir.

Fórmula de aptámero de arranque en caliente → Proporcione el 100 % de actividad enzimática inmediatamente y evite la amplificación no específica a bajas temperaturas (<57 °C).

Función de escisión → Se omite el paso de extracción de ARN, porque la ADN polimerasa RevTaq RT-PCR también puede procesar muestras de reacción crudas.Puede destruir inmediatamente las membranas celulares de eucariotas, bacterias y virus en un ciclo de RT-PCR en caliente.

Nivel de materia prima IVD → altos estándares de calidad y precios extremadamente competitivos