Consejos para mejorar la recuperación de pegamento

1. Aumente la carga de muestra durante la electroforesis.

2. Use tampón de electroforesis recién preparado.

3. Al cortar pegamento, intente cortar solo el pegamento con tiras para reducir el volumen de corte de pegamento: no necesita pegamento con pocos fragmentos de propósito, de lo contrario, afectará la tasa de recuperación.

4. Después de derretir dos o más piezas de pegamento, use un tubo sin importar cuán grande sea el volumen y transfiéralo a la misma columna.

5. La solución añadida en el sol puede ser un poco más, lo que favorece más la unión del ADN a la membrana, pero por lo general no superan los 750ul.

6. La clave para la recuperación del gel es unir el ADN a la columna a través de la concentración de sal, la acidez (carga) y la hidrofobicidad de la solución en la columna.Por lo tanto, si el pH del tampón de electroforesis es demasiado alto, se pueden agregar 10 ul (pH 5,0, 3 mol/L NaAC) al sol;para interceptar mejor las moléculas de ADN en la membrana, se puede agregar isopropanol al 30% para calentar el líquido después de disolver el pegamento.

7. Antes de añadir el eluyente, deje la columna a temperatura ambiente durante unos minutos (unos 10 minutos) para que se evapore completamente el etanol.

8. Finalmente, agregue menos eluyente para minimizar el volumen de recuperación.Generalmente, se utilizan 30-50 μl de eluyente para la elución (no demasiado poco, de lo contrario no podrá humedecer la membrana, lo que no favorece la elución);las gotitas de elución están en el centro de la membrana, para eluir completamente el ADN unido a la membrana.

9. Después de agregar el eluyente, puede eluirse en un baño de agua a 55 grados durante 5 minutos o colocarse en un baño de agua a 50 grados durante más de 10 minutos, o sellarse con un parafilm a 4 grados durante la noche y luego centrifugarse para recuperarse al día siguiente, el efecto es bueno.

10.Agregue el eluato centrifugado nuevamente a la columna de adsorción y centrifugue nuevamente.

Métodos y procedimientos detallados para la recuperación de productos de PCR

1. Reciclaje ordinario de caucho

Si desea recuperar el pegamento, lo mejor es usar un kit, que es conveniente y tiene una tasa de recuperación ligeramente superior.Si realmente necesita recuperarlo manualmente, puede agregar 3 veces el volumen de TE después de cortar el pegamento.Después de fundir en un baño de agua, el fenol, el fenol/cloroformo se extraen limpiamente y el etanol se precipita.Eso es todo.

2. Recuperación de ADN de geles de bajo punto de fusión

Purificación de fragmentos de ADN Agregue TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) en una cantidad equivalente al volumen del gel y colóquelo en un baño de agua a 65 °C durante 5 minutos para disolver el gel por completo.

Después de llevarla a temperatura ambiente, se añadió una cantidad igual de fenol (saturado con TE, TE se selló en la capa superior y se eliminó la capa inferior de fenol), y la mezcla se mezcló suavemente (no se requirió mezclar) y se centrifugó a 12 000 rpm durante 3 minutos.Repita 1-2 veces.

Tome el sobrenadante, agregue 0,1 volumen de acetato de sodio de 3 mol/L (pH 5,2) y 2,5 veces el volumen de etanol absoluto para llevar a cabo la precipitación con etanol.Disuelva el ADN purificado con una cantidad adecuada de TE, mida el contenido y prepárelo para su uso (se puede utilizar para el análisis de la estructura del gen objetivo, la preparación de la sonda, etc.).

3. Recuperación de PCR con buena especificidad de amplificación

Si la especificidad de la amplificación por PCR es buena, es solo una simple purificación y recuperación del producto de la PCR.Puede agregar 50 ug/ml de proteinasa K al producto de PCR, 37 grados durante 1 h, extraer una vez con fenol/cloroformo, extraer una vez con cloroformo y agregar 0,1 volumen del sobrenadante.El acetato de sodio se recuperó por precipitación con 2,5 volúmenes de etanol absoluto.

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