Como nuevo en el laboratorio, no es un buen trabajo descartar plantas positivas de un grupo de plantas con una baja tasa de conversión.En primer lugar, el ADN debe extraerse de una gran cantidad de muestras una por una, y luego los genes extraños se detectarán mediante PCR.Sin embargo, los resultados a menudo son espacios en blanco y bandas con algunos elementos ocasionalmente, pero es imposible determinar si hay detecciones perdidas o detecciones falsas..¿Es muy impotente enfrentar tal proceso experimental y resultados?No te preocupes, hermano te enseña cómo descartar plantas transgénicas positivas de manera fácil y precisa.

Paso 1

Cebadores de detección de diseño

Determine el gen endógeno y el gen exógeno que se detectará de acuerdo con la muestra que se analizará y seleccione una secuencia representativa de 100-500 pb en el gen para el diseño de cebadores.Los buenos cebadores pueden garantizar la precisión de los resultados de detección y acortar el tiempo de detección (consulte el apéndice para conocer los cebadores de detección de uso común).

Aviso: los cebadores de nuevo diseño deben optimizar las condiciones de reacción y verificar la exactitud, la precisión y el límite de detección de la detección antes de la detección a gran escala.

Paso 2

Diseño de protocolo experimental

Control positivo: use el ADN purificado que contiene el fragmento objetivo como plantilla para determinar si el sistema de reacción de PCR y las condiciones son normales.

Control negativo/en blanco: use la plantilla de ADN o ddH2O que no contiene el fragmento objetivo como plantilla para detectar si existe una fuente de contaminación en el sistema de PCR.

Control de referencia interno: utilice la combinación cebador/sonda del gen endógeno de la muestra que se va a analizar para evaluar si la plantilla se puede detectar mediante PCR.

Aviso:

Se deben establecer controles positivos, negativos/en blanco y controles internos para cada prueba para evaluar la validez de los resultados experimentales.

Preparación del experimento

Antes de usar, observe si la solución se mezcla uniformemente.Si se encuentra precipitación, debe disolverse y mezclarse de acuerdo con las instrucciones antes de su uso.La mezcla 2×PCR debe pipetearse y mezclarse repetidamente con una micropipeta antes de su uso para evitar una distribución irregular de iones.

Aviso:

Saque el manual y léalo cuidadosamente, y haga los preparativos antes del experimento en estricta conformidad con los requisitos del manual.

Etapa 4

Preparar el sistema de reacción de PCR

De acuerdo con el protocolo experimental, mezcle los cebadores, H2O y 2xPCR de manera uniforme, centrifugue y distribúyalos en cada tubo de reacción.

Aviso:

Para pruebas a gran escala o a largo plazo, se recomienda utilizar un sistema de reacción de PCR que contenga enzima UNG, que puede evitar de manera efectiva la contaminación por aerosol causada por los productos de PCR.

Paso 5

Agregar plantilla de reacción

Con la tecnología de PCR directa, no hay necesidad de un tedioso proceso de purificación de ácido nucleico, la plantilla de muestra se puede preparar en 10 minutos y se puede agregar el sistema de reacción de PCR correspondiente.

Aviso:

El método de escisión tiene un mejor efecto de detección y el producto obtenido puede usarse para múltiples reacciones de detección.

5.1: Expansión directa de hojas

De acuerdo con el tamaño de la imagen en el manual, corte el tejido de la hoja con un diámetro de 2-3 mm y colóquelo en el sistema de reacción de PCR.

Nota: asegúrese de que los fragmentos de hoja estén completamente sumergidos en la solución de reacción de PCR y no agregue demasiado tejido de hoja.

5.2: Método de división de hojas

Corte el tejido de la hoja con un diámetro de 5-7 mm y colóquelo en un tubo de centrífuga.Si elige hojas maduras, evite usar los tejidos de la nervadura principal de la hoja.Pipetee 50 ul de lisado de tampón P1 en un tubo de centrífuga para asegurarse de que el lisado pueda sumergir completamente el tejido de la hoja, colóquelo en un termociclador o en un baño de metal y lisis a 95 °C durante 5-10 minutos.

Agregue 50 ul de solución de neutralización de tampón P2 y mezcle bien.El lisado resultante puede usarse como plantilla y agregarse al sistema de reacción de PCR.

Nota: La cantidad de plantilla está entre el 5 y el 10 % del sistema de PCR y no debe exceder el 20 % (por ejemplo, en un sistema de PCR de 20 μl, agregue 1-2 μl de solución de lisis, no más de 4 μl).

Paso 6

reacción de PCR

Después de centrifugar el tubo de reacción de PCR, se coloca en un instrumento de PCR para su amplificación.

Aviso:

La reacción utiliza una plantilla no purificada para la amplificación, por lo que el número de ciclos de amplificación es de 5 a 10 ciclos más que cuando se utiliza una plantilla de ADN purificada.

Paso 7

Detección de electroforesis y análisis de resultados.

M: escalera de ADN de 100 pb

1\4: método de ADN purificado

2\5: método PCR directo

3\6: control en blanco

Control de calidad:

Los resultados de las pruebas de los diversos controles establecidos en el experimento deben cumplir las siguientes condiciones.De lo contrario, se debe analizar la causa del problema y se debe realizar la prueba nuevamente después de eliminar el problema.

Tabla 1. Resultados normales de las pruebas de varios grupos de control

*Cuando el plásmido se utiliza como control positivo, el resultado de la prueba del gen endógeno puede ser negativo

Juicio de resultado:

A. El resultado de la prueba del gen endógeno de la muestra es negativo, lo que indica que el ADN adecuado para la detección por PCR ordinaria no se puede extraer de la muestra o que el ADN extraído contiene inhibidores de la reacción de PCR, y el ADN debe extraerse nuevamente.

B. El resultado de la prueba del gen endógeno de la muestra es positivo y el resultado de la prueba del gen exógeno es negativo, lo que indica que el ADN adecuado para la detección por PCR ordinaria se extrae de la muestra y se puede juzgar que el gen XXX no se detecta en la muestra.

C. El resultado de la prueba del gen endógeno de la muestra es positivo y el resultado de la prueba del gen exógeno es positivo, lo que indica que se extrajo de la muestra ADN adecuado para la detección por PCR ordinaria y que el ADN de la muestra contiene el gen XXX.Los experimentos de confirmación se pueden llevar a cabo más.

Paso 8

Cebadores de detección de diseño

Después del experimento, use una solución de hipoclorito de sodio al 2% y una solución de etanol al 70% para limpiar el área experimental y evitar la contaminación ambiental。