Todos hablan sobre el principio del experimento qRT-PCR, el diseño de cebadores, la interpretación de resultados, etc., pero creo que debería compartir con ustedes el funcionamiento experimental de qRT-PCR.Es pequeño, pero se trata de resultados.
Antes de hacer qRT-PCR, debemos tener una comprensión clara de nuestro propio ARN y métodos de operación.Después de todo, nuestros esfuerzos están dirigidos a obtener resultados, en lugar de simplemente practicar.Entonces, antes de hacer qRT-PCR, debemos determinar los siguientes problemas (algunos de los cuales solo se aplican a SYBR).
1 ¿Estás seguro de que tu ARN no está degradado?
NanoDrop 2000 solo puede detectar la concentración y la pureza del ARN, pero no puede detectar la integridad del ARN.
El valor de ARN (Número de intensidad de ARN) puede reflejar la integridad del ARN, que es detectado por el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagrama esquemático de valores RIN para diferentes muestras de ARN (eucariotas)
Sin embargo, los laboratorios generalmente no cuentan con el Bioanalizador Agilent 2100.En este caso, podemos detectar a través de gel de formaldehído, pero el requisito de la cantidad total de ARN es alto, por lo que el método más rápido es usar electroforesis en gel ordinaria.Se requiere estar en un ambiente libre de nucleasas, por lo que es necesario enjuagar el tanque de electroforesis, la botella de sol, el soporte de gel y el peine con agua DEPC.La agarosa también está libre de nucleasas (siempre y cuando esté recién abierta), y el tampón de carga debe estar recién abierto tanto como sea posible, con gel al 1,2 %.
Tenga en cuenta que el gel debe estar completamente disuelto, de lo contrario, se producirán bandas no homogéneas, como se muestra en la muestra 9 de la figura.Si el voltaje es demasiado alto o funciona durante demasiado tiempo, generará calor y causará la degradación del ARN, por lo que el voltaje y el tiempo deben controlarse razonablemente.Además, la ejecución del gel también puede determinar aún más si hay residuos de ADN en la muestra y observar si hay una gran cantidad de bandas retenidas en el pozo dispensador.
Cifra.Detección de ARN por electroforesis en gel
2 ¿Estás seguro de la concentración de tu ADNc?
La experiencia de los hermanos mayores en el laboratorio es que el cDNA del sistema de 20 ul obtenido por cada inversión se diluye directamente 20X, mientras que las hermanas posdoctorales se diluyen 10X.Normalmente dependo de la situación.Debido a que la calidad del ARN mencionado por cada persona es diferente, el nivel de reversión también es diferente y la tecnología de reversión puede no ser estable.
Entonces, cada vez que obtengo el ADNc invertido, primero lo diluyo unas 3 veces y luego uso el gen de limpieza para hacer RT-PCR, el número de ciclos es generalmente 25 ciclos, para identificar la concentración específica y luego determinar el factor de dilución final.
3 ¿Estás seguro de que tus primers son fáciles de usar?
Puede pasar la curva de fusión de qRT-PCR, pero aún cuesta dinero.Para laboratorios sin mucho dinero, cuando obtienen muchos cebadores, pueden usar RT-PCR ordinaria para ver si es una sola banda e identificar la especificidad de los cebadores.Si el laboratorio no anda corto de dinero, la especificidad de todos los cebadores se puede identificar una vez a través de la curva de fusión.
4 ¿Está seguro de que sus condiciones experimentales son adecuadas?
SYBR debe protegerse de la luz fuerte, así que intente apagar la luz superior cuando agregue el reactivo SYBR, y solo necesita usar una luz tenue para completarlo.
Almacenar SYBR a 4°C.Cuando esté en uso, invierta suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien y evitar la formación de espuma, y no agite con fuerza.
A algunas hermanas menores les gusta dibujar marcas en la placa de PCR por temor a mezclar las muestras, lo cual está mal.Debido a que es muy probable que sus marcadores afecten la recopilación de señales fluorescentes, generalmente recomiendo a los jóvenes que usen cuadernos experimentales para ayudar en la memoria, como se muestra a continuación.
Cifra.Diagrama de carga de muestras de qRT-PCR
5 ¿Estás seguro de que lo estás haciendo bien?
Asegúrese de usar guantes, usar guantes, usar guantes y decir las cosas importantes tres veces.
Para reducir la exposición de SYBR a la luz, personalmente prefiero agregar primero una plantilla, como se muestra en la siguiente figura.Según la experiencia, es probable que la adición de una pequeña cantidad de plantilla cause errores de muestreo.Por lo tanto, para minimizar el error causado por agregar una pequeña cantidad de plantilla, generalmente doblo la muestra nuevamente y doblo la cantidad al agregar la muestra para reducir la cantidad de H2O2 agregada.
Cifra.Diagrama esquemático de la carga de qRT-PCR
Luego configure el sistema qRT-PCR de la siguiente manera.
Cifra.diagrama de preparación del sistema qRT-PCR
NOTA: El proceso de configuración debe realizarse en hielo.
Después de agregar la muestra, pegue la película de sellado transparente.Trate de no tocar la superficie de la película de sellado transparente con las manos, solo opere desde el espacio a ambos lados de la película.Porque las huellas dactilares también pueden afectar la recopilación de señales fluorescentes.Luego use una centrífuga para centrifugar rápidamente durante 10 s a baja velocidad para evitar que la muestra cuelgue de la pared.
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Hora de publicación: 28-abr-2023
