La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una de las tecnologías de amplificación de ADN in vitro, con una historia de más de 30 años.

La tecnología de PCR fue iniciada por Kary Mullis de Cetus, EE. UU. en 1983. Mullis solicitó una patente de PCR en 1985 y publicó el primer artículo académico de PCR sobre ciencia ese mismo año.Mullis recibió el Premio Nobel de química en 1993 por su trabajo.

Principios básicos de PCR

La PCR puede amplificar fragmentos de ADN diana más de un millón de veces.El principio está bajo la catálisis de la ADN polimerasa, utilizando la hebra de ADN original como molde y el cebador específico como punto de partida para la extensión.Se replica in vitro a través de pasos como la desnaturalización, el recocido y la extensión.El proceso del ADN de la hebra hija complementario al ADN molde de la hebra progenitora.

El proceso de PCR estándar se divide en tres pasos:

1. Desnaturalización: use altas temperaturas para separar las dobles cadenas de ADN.El enlace de hidrógeno entre las cadenas dobles de ADN se rompe a altas temperaturas (93-98 ℃).

2. Recocido: después de separar el ADN de doble cadena, baje la temperatura para que el cebador pueda unirse al ADN de cadena sencilla.

3. Extensión: la ADN polimerasa comienza a sintetizar cadenas complementarias a lo largo de las cadenas de ADN a partir de los cebadores unidos cuando se baja la temperatura.Cuando se completa la extensión, se completa un ciclo y el número de fragmentos de ADN se duplica.

Alternando estos tres pasos 25-35 veces, el número de fragmentos de ADN aumentará exponencialmente.

El ingenio de la PCR es que se pueden diseñar diferentes cebadores para diferentes genes objetivo, de modo que los fragmentos de genes objetivo se puedan amplificar en un corto período de tiempo.

Hasta ahora, la PCR se puede dividir en tres categorías, a saber, la PCR ordinaria, la PCR cuantitativa fluorescente y la PCR digital.

La primera generación de PCR ordinaria

Use un instrumento de amplificación de PCR ordinario para amplificar el gen objetivo y luego use electroforesis en gel de agarosa para detectar el producto, solo se puede realizar un análisis cualitativo.

Las principales desventajas de la PCR de primera generación:

1. Propenso a la amplificación no específica y resultados falsos positivos.

2. La detección lleva mucho tiempo y la operación es engorrosa.

3. Solo se puede realizar una prueba cualitativa.

PCR en tiempo real de segunda generación

La PCR en tiempo real, también conocida como qPCR, utiliza sondas fluorescentes que pueden indicar el progreso del sistema de reacción y monitorea la acumulación de productos amplificados a través de la acumulación de señales fluorescentes y juzga los resultados a través de la curva de fluorescencia.Se puede cuantificar con la ayuda del valor Cq y la curva estándar.

Debido a que la tecnología qPCR se lleva a cabo en un sistema cerrado, la probabilidad de contaminación se reduce y la señal de fluorescencia se puede monitorear para la detección cuantitativa, por lo que es la más utilizada en la práctica clínica y se ha convertido en la tecnología dominante en PCR.

Las sustancias fluorescentes utilizadas en la PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real se pueden dividir en: sonda fluorescente TaqMan, balizas moleculares y colorante fluorescente.

1) Sonda fluorescente TaqMan:

Durante la amplificación por PCR, se agrega una sonda fluorescente específica mientras se agrega un par de cebadores.La sonda es un oligonucleótido y ambos extremos están marcados con un grupo fluorescente informador y un grupo fluorescente extintor.

Cuando la sonda está intacta, la señal fluorescente emitida por el grupo informador es absorbida por el grupo desactivador;Durante la amplificación por PCR, la actividad de exonucleasa 5′-3′ de la enzima Taq escinde y degrada la sonda, lo que hace que el grupo fluorescente indicador y el extintor se separen, de modo que el sistema de monitoreo de fluorescencia pueda recibir la señal de fluorescencia, es decir, cada vez que se amplifica una cadena de ADN, se forma una molécula fluorescente y la acumulación de la señal de fluorescencia está completamente sincronizada con la formación del producto de PCR.

2) colorante fluorescente SYBR:

En el sistema de reacción de PCR, se agrega un exceso de colorante fluorescente SYBR.Después de que el colorante fluorescente SYBR se incorpora de forma no específica a la cadena doble de ADN, emite una señal fluorescente.La molécula de colorante SYBR que no se incorpora a la cadena no emitirá ninguna señal fluorescente, lo que garantiza que la señal fluorescente esté completamente sincronizada con el aumento de productos de PCR.SYBR solo se une al ADN de doble cadena, por lo que la curva de fusión se puede utilizar para determinar si la reacción de PCR es específica.

3) Baliza molecular:

Es una sonda de oligonucleótidos de doble marcaje de tallo y bucle que forma una estructura de horquilla de aproximadamente 8 bases en los extremos 5 y 3.Las secuencias de ácido nucleico en ambos extremos se emparejan de manera complementaria, lo que hace que el grupo fluorescente y el grupo de extinción estén unidos.Cerrar, no se producirá fluorescencia.

Después de que se genera el producto de PCR, durante el proceso de hibridación, la parte media de la baliza molecular se empareja con una secuencia de ADN específica y el gen fluorescente se separa del gen extintor para producir fluorescencia.

Las principales desventajas de la PCR de segunda generación:

Todavía falta sensibilidad y la detección de muestras con pocas copias es imprecisa.

Existe la influencia del valor de fondo, y el resultado es susceptible de interferencia.

Cuando hay inhibidores de PCR en el sistema de reacción, los resultados de detección son susceptibles a interferencias.

PCR digital de tercera generación

La PCR digital (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcula el número de copias de la secuencia objetivo a través de la detección del punto final y puede realizar una detección cuantitativa absoluta precisa sin usar controles internos ni curvas estándar.

La PCR digital utiliza detección de punto final y no depende del valor Ct (umbral del ciclo), por lo que la reacción de PCR digital se ve menos afectada por la eficiencia de amplificación y se mejora la tolerancia a los inhibidores de la reacción de PCR, con alta precisión y reproducibilidad.

Debido a las características de alta sensibilidad y alta precisión, los inhibidores de la reacción de PCR no interfieren fácilmente, y puede lograr una cuantificación absoluta verdadera sin productos estándar, lo que se ha convertido en un punto crítico de investigación y aplicación.

De acuerdo con las diferentes formas de la unidad de reacción, se puede dividir en tres tipos principales: sistemas de microfluidos, chips y gotitas.

1) PCR digital microfluídica, mdPCR:

Basado en la tecnología de microfluidos, la plantilla de ADN se separa.La tecnología de microfluidos puede realizar la mejora nanométrica de la muestra o la generación de gotas más pequeñas, pero las gotas necesitan un método de adsorción especial y luego se combinan con el sistema de reacción de PCR.mdPCR ha sido adoptado gradualmente por otros métodos de reemplazo.

2) PCR digital basada en gotas, ddPCR:

Utilice la tecnología de generación de gotas de agua en aceite para procesar la muestra en gotas y divida el sistema de reacción que contiene moléculas de ácido nucleico en miles de gotas a nanoescala, cada una de las cuales no contiene la molécula objetivo de ácido nucleico que se va a detectar o contiene una o varias moléculas objetivo de ácido nucleico que se van a analizar.

3) PCR digital basada en chip, cdPCR:

Utilice la tecnología de vía de fluido integrada para grabar muchos microtubos y microcavidades en obleas de silicio o vidrio de cuarzo, y controle el flujo de la solución a través de diferentes válvulas de control, y divida el líquido de muestra en nanómetros del mismo tamaño en los pocillos de reacción para la reacción de PCR digital para lograr una cuantificación absoluta.

Las principales desventajas de la PCR de tercera generación:

El equipo y los reactivos son caros.

Los requisitos de calidad de la plantilla son altos.Si la cantidad de plantilla supera la cantidad de microsistema, será imposible cuantificar, y si es demasiado pequeña, se reducirá la precisión de cuantificación.

También se pueden generar falsos positivos cuando hay amplificación inespecífica.