Máquina PCR|¿Realmente entiendes?

Tecnología PCR ganadora del Premio Nobel

En 1993, el científico estadounidense Mulis recibió el Premio Nobel de Química y su logro fue la invención de la tecnología PCR.La magia de la tecnología PCR está en las siguientes características: en primer lugar, la cantidad de ADN que se amplifica es extremadamente pequeña y, en teoría, se puede usar una molécula para la amplificación;en segundo lugar, la eficiencia de amplificación es alta y la cantidad del gen diana es exponencial.Amplificación, más de 10 millones de veces en unas pocas horas.Ahora, el instrumento PCR se ha utilizado ampliamente en la investigación de ciencias de la vida y en muchos otros aspectos.

Diferentes modelos y fabricantes de termocicladores pueden exhibir diferente rendimiento y repetibilidad.Estas diferencias afectan no solo a la eficiencia de la PCR sino también a la precisión y consistencia de los datos obtenidos.Comprender las características de la máquina PCR puede ayudarnos a maximizar el éxito de nuestros experimentos.

Módulo de calefacción

La precisión de la temperatura del termociclador puede ser decisiva para el éxito o el fracaso de la PCR.La uniformidad de la temperatura entre pocillos en el bloque calefactor también es fundamental para obtener resultados de PCR fiables y reproducibles.

Una forma de garantizar la precisión térmica es probar con frecuencia utilizando kits de verificación de temperatura y volver a calibrar según sea necesario por un profesional capacitado.Las pruebas de verificación de temperatura se utilizan normalmente para:

Precisión de pozo a pozo relativa a la temperatura establecida en modo isotérmico

Precisión de pozo a pozo relativa a la temperatura establecida después de la conversión de temperatura

Precisión de la temperatura de la tapa térmica

Control de temperatura de recocido de imprimación

El control de temperatura de gradiente es una función del instrumento de PCR que facilita la optimización del recocido de cebadores en PCR.El propósito de la configuración del gradiente es lograr temperaturas variables entre los módulos, y con un aumento y disminución de la temperatura de ≥2 °C entre cada columna, se pueden probar diferentes temperaturas simultáneamente para obtener la temperatura óptima de recocido de la imprimación.Teóricamente, un verdadero gradiente logra una temperatura lineal entre módulos.

Sin embargo, los termocicladores de gradiente convencionales generalmente emplean un solo bloque térmico y controlan la temperatura a través de dos elementos de calentamiento y enfriamiento ubicados en ambos extremos, lo que a menudo genera las siguientes limitaciones:

Solo se pueden establecer dos temperaturas: las temperaturas alta y baja para el recocido de imprimación se establecen en ambos extremos del módulo térmico, y no se puede lograr un ajuste preciso de otras temperaturas entre módulos.

Debido al intercambio de calor entre las diferentes columnas, es más probable que la temperatura entre las diferentes regiones del módulo siga una curva sigmoidal en lugar de un verdadero gradiente lineal.

Temperatura de la muestra

La capacidad del termociclador para controlar la temperatura de la muestra es muy importante para la precisión de los resultados de la PCR.Los parámetros específicos del instrumento, como velocidades de rampa, tiempos de espera y algoritmos, son fundamentales para predecir la temperatura de la muestra.

La tasa de calentamiento y enfriamiento de la máquina de PCR significa que la temperatura cambia entre los pasos de PCR que ocurren durante un cierto período de tiempo.Dado que el calor tarda cierto tiempo en transferirse del módulo a la muestra, la velocidad real de calentamiento y enfriamiento de la muestra será más lenta.Por lo tanto, es necesario distinguir y comprender la definición de velocidad de cambio de temperatura.

La tasa de rampa máxima o pico del módulo representa el cambio de temperatura más rápido que el módulo puede lograr en un período de tiempo muy pequeño durante la rampa.

La tasa de rampa de bloque promedio representa la tasa de cambio de temperatura durante un período de tiempo más largo y proporcionará una medida más representativa de la velocidad de la máquina de PCR.

La tasa máxima de calentamiento y enfriamiento de la muestra y la tasa promedio de calentamiento y enfriamiento de la muestra reflejan la temperatura real obtenida por la muestra.La tasa de calentamiento y enfriamiento de la muestra proporcionará una comparación más precisa del rendimiento de la máquina de PCR y su impacto potencial en los resultados de la PCR.

Al realizar un reemplazo del ciclador, se recomienda utilizar un instrumento con un programa de velocidad de rampa que simule el modo anterior para un reemplazo más fácil y un impacto mínimo en la repetibilidad de la PCR.

El termociclador debe estar diseñado para cronometrar los pasos solo después de que la muestra alcance la temperatura establecida.De esta forma, el tiempo que la muestra se mantiene a la temperatura establecida se mantendrá con mayor precisión con las condiciones de ciclo correspondientes requeridas en el procedimiento operativo.

Los termocicladores a menudo usan algoritmos matemáticos complejos para garantizar que las muestras puedan alcanzar rápidamente una temperatura establecida de acuerdo con un programa preestablecido.Según el volumen del sistema de reacción y el grosor de los plásticos de PCR utilizados, el algoritmo puede predecir la temperatura de la muestra y el tiempo que tardará en alcanzar la temperatura establecida.Basándose en estos algoritmos, durante el proceso de calentamiento o enfriamiento del termociclador, la temperatura del bloque generalmente excederá el valor establecido a través de un proceso llamado exceso o defecto del bloque térmico.Esta configuración garantiza que la muestra alcance la temperatura establecida lo más rápido posible sin sobrepasarse ni subestimarse.

Rendimiento experimental

Los factores que pueden aumentar el rendimiento de un termociclador incluyen velocidades de rampa, configuraciones de bloques térmicos e integración de plataformas de automatización.

La velocidad de calentamiento y enfriamiento del termociclador representa la velocidad a la que alcanza la temperatura establecida.Cuanto más rápido suba y baje la temperatura, más rápido se ejecutará la PCR, lo que significa que se pueden completar más experimentos en un período de tiempo determinado.Además, los experimentos se pueden acelerar mediante el uso de polimerasas de ADN más rápidas.

El diseño del módulo termociclador también es fundamental para los experimentos de PCR.Por ejemplo, los módulos reemplazables permiten flexibilidad en la cantidad de muestras por ejecución.Además, los módulos de calentamiento con módulos controlables individualmente son ideales para ejecutar diferentes programas de PCR simultáneamente en un termociclador.

Para la PCR de alto rendimiento automatizada, el software que controla el sistema de manejo de pipeteo debe ser programable y compatible.Los sistemas automatizados son ideales para realizar reacciones de PCR de alto rendimiento porque se pueden ejecutar de forma continua con poca intervención humana, lo que minimiza el tiempo necesario para la configuración experimental manual y aumenta el número de reacciones en un período de tiempo determinado.

Fiabilidad, durabilidad y garantía de calidad de termocicladores

Además de las capacidades de rendimiento y rendimiento, la máquina de PCR también debe poder soportar ciertas condiciones de uso repetido, estrés ambiental y transporte.Algunos fabricantes pueden informar sobre cómo el instrumento realiza las pruebas de confiabilidad y durabilidad.La detección del instrumento de PCR correspondiente incluye:

Confiabilidad: los equipos mecánicos se utilizan para realizar pruebas repetidas en componentes de instrumentos de uso frecuente, como tapas térmicas, paneles de control/pantallas táctiles y módulos de ciclos de temperatura.

Presión ambiental: las cámaras ambientales se pueden usar para simular diferentes condiciones de experimentos de rutina, como temperatura, humedad.

Pruebas de envío: se pueden realizar pruebas intensas de choque y vibración de acuerdo con los estándares de la Asociación Internacional de Seguridad en el Transporte para garantizar que el instrumento pueda llegar en condiciones de funcionamiento sin daños.

Garantía y servicio para el mantenimiento de la máquina PCR

A pesar de las rigurosas pruebas de confiabilidad y durabilidad, los termocicladores inevitablemente tienen problemas técnicos durante la vida útil del instrumento.Para su tranquilidad, se debe considerar la garantía, el servicio y el mantenimiento del fabricante al comprar un instrumento.

La flexibilidad de los servicios, como el mantenimiento in situ/de regreso a la fábrica, los servicios de monitoreo remoto y los instrumentos de reemplazo en el proceso de mantenimiento, etc., para reducir el impacto en la eficiencia del trabajo.

La duración del período de garantía, el tiempo de respuesta del servicio, la accesibilidad del soporte técnico y las habilidades del personal de soporte profesional.

Viabilidad de la instalación, operación, cooperación y verificación del instrumento para cumplir con los requisitos regulatorios relacionados y de laboratorio.Los servicios de mantenimiento, como la verificación de la temperatura, las pruebas y la calibración, están disponibles para garantizar que el instrumento funcione correctamente con los parámetros correspondientes.

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