La PCR es la tecnología de amplificación de ácidos nucleicos más utilizada debido a su sensibilidad y especificidad.Sin embargo, la PCR requiere una desnaturalización térmica repetida y no puede eliminar las limitaciones de depender de instrumentos y equipos, lo que limita su aplicación en las pruebas de campo clínico.
Desde principios de la década de 1990, muchos laboratorios han comenzado a desarrollar tecnología de amplificación a temperatura constante que no requiere desnaturalización térmica.Ahora han desarrollado tecnología de amplificación isotérmica mediada por bucle, tecnología de amplificación isotérmica de reemplazo de cadena, tecnología de amplificación isotérmica de círculo rodante y dependencia de secuencia de ácido nucleico.Tecnología de amplificación isotérmica y otras tecnologías.
Lamplificación isotérmica mediada por oop
El principio de amplificación se basa en el hecho de que el ADN se encuentra en un estado de equilibrio dinámico a unos 65 °C.Cuando cualquier cebador tiene pares de bases y se extiende a la parte complementaria del ADN de doble cadena, la otra cadena se disociará y se convertirá en cadena sencilla.
A esta temperatura, el ADN utiliza 4 cebadores específicos para depender de una polimerasa de ADN de desplazamiento de cadena para hacer que la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena autocircule continuamente.
Primero determine las 6 regiones específicas F3, F2, F1, B1, B2, B3 en el gen objetivo y luego diseñe 4 cebadores basados en estas 6 regiones específicas (como se muestra en la figura a continuación):
El cebador interno directo (FIP) está compuesto por F1c y F2.
El cebador interno hacia atrás (BIP) está compuesto por B1c y B2, y TTTT se usa como espaciador en el medio.
Los cebadores externos F3 y B3 están compuestos respectivamente por regiones F3 y B3 en el gen diana.
En el sistema de reacción LAMP, la concentración del cebador interno es varias veces mayor que la del cebador externo.El cebador interno se combina primero con la hebra molde para sintetizar una hebra complementaria para formar una doble hebra de ADN.Posteriormente, el cebador externo se combina con la hebra molde para formar una doble hebra de ADN.Bajo la acción de la BstDNA polimerasa, se libera la cadena complementaria sintetizada por el cebador interno.Después de una serie de reacciones, la hebra complementaria finalmente forma una sola hebra de ADN con una estructura en forma de pesa.
La cadena simple de ADN de estructura en mancuerna en sí misma se usa como plantilla para formar continuamente una estructura de ADN de transición de tallo-bucle con un extremo abierto.Los cebadores interno y externo guían la estructura transicional de bucle de tallo de ADN para que experimente continuamente reacciones de extensión y desplazamiento de cadena, y finalmente forme múltiples estructuras de bucle de tallo con diferentes longitudes.mezcla de ADN.
Ventajas y desventajas de la amplificación isotérmica mediada por bucle
Ventajas de la lámpara:
(1) Alta eficiencia de amplificación, que puede amplificar efectivamente de 1 a 10 copias del gen objetivo en 1 h, y la eficiencia de amplificación es de 10 a 100 veces mayor que la de la PCR ordinaria.
(2) El tiempo de reacción es corto, la especificidad es fuerte y no se requiere equipo especial.
Deficiencias de LAMP:
(1) Los requisitos para las imprimaciones son particularmente altos.
(2) El producto amplificado no puede usarse para clonación y secuenciación, sino que solo puede usarse para juicio.
(3) Debido a su fuerte sensibilidad, es fácil formar aerosoles, causando falsos positivos y afectando los resultados de la prueba.
Samplificación de desplazamiento de banda
La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) es una técnica de amplificación de ADN isotérmica in vitro basada en una reacción enzimática propuesta por primera vez por el académico estadounidense Walker en 1992.
El sistema básico de SDA incluye una endonucleasa de restricción, una polimerasa de ADN con actividad de desplazamiento de cadena, dos pares de cebadores, dNTP y sistemas tampón e iones de calcio y magnesio.
El principio de la amplificación por desplazamiento de cadena se basa en la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción modificada químicamente en ambos extremos del ADN diana.La endonucleasa abre la brecha en la cadena de ADN en su sitio de reconocimiento, y la ADN polimerasa extiende la brecha en el extremo 3 'y reemplaza la siguiente cadena de ADN.
Las cadenas sencillas de ADN reemplazadas pueden combinarse con cebadores y extenderse a cadenas dobles mediante la ADN polimerasa.Este proceso se repite continuamente, de manera que la secuencia diana se amplifica de forma eficaz.
Ventajas y desventajas de la tecnología de amplificación por desplazamiento de cadena
Ventajas de SDA:
La eficiencia de amplificación es alta, el tiempo de reacción es corto, la especificidad es fuerte y no se requiere equipo especial.
Deficiencias de SDA:
Los productos no son uniformes, y algunos productos monocatenarios y bicatenarios siempre se producen en el ciclo SDA, e inevitablemente se producirán colas cuando se detecten por electroforesis.
Ramplificación del círculo rodante
La amplificación por círculo rodante (RCA) se propone basándose en el método de copiar ADN de organismos patógenos por círculo rodante.Se refiere al uso de ADN circular monocatenario como plantilla a una temperatura constante, y una polimerasa de ADN especial (como Phi29) bajo la acción de la síntesis de ADN de círculo rodante para lograr la amplificación del gen objetivo.
RCA se puede dividir en amplificación lineal y amplificación exponencial.La eficiencia de RCA lineal puede alcanzar 105veces, y la eficiencia de RCA exponencial puede llegar a 109veces.
Distinción simple, como se muestra en la figura a continuación, la amplificación lineal a solo usa 1 cebador, la amplificación exponencial b tiene 2 cebadores.
El RCA lineal también se denomina RCA de cebador simple.Un cebador se une al ADN circular y se extiende por la acción de la ADN polimerasa.El producto es una hebra simple lineal con una gran cantidad de secuencias repetitivas miles de veces la longitud de un solo bucle.
Dado que el producto de RCA lineal siempre está conectado al cebador de partida, la fácil fijación de la señal es una gran ventaja.
RCA exponencial, también conocido como amplificación hiperramificada HRCA (RCA hiperramificada), en RCA exponencial, un cebador amplifica el producto RCA, el segundo cebador se hibrida con el producto RCA y se extiende, y el reemplazo ya está unido al producto RCA. Los cebadores aguas abajo extienden la hebra y repiten la extensión y el reemplazo para producir un producto de amplificación RCA dendrítica.
Las ventajas y desventajas de la amplificación de ácido nucleico de círculo rodante
Ventajas de RCA:
Alta sensibilidad, buena especificidad y fácil operación.
Deficiencias de RCA:
Problemas de fondo durante la detección de señales.Durante la reacción RCA, la sonda de candado sin circular y el ADN o ARN molde de la sonda no unida pueden generar algunas señales de fondo.
Namplificación basada en secuencias de ácido ucleico
La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) es una nueva tecnología desarrollada sobre la base de la PCR.Es una amplificación continua e isotérmica de ácidos nucleicos guiada por un par de cebadores con una secuencia promotora de T7.La tecnología puede amplificar la plantilla de ARN unas 109 veces en unas 2 horas, que es 1000 veces más que el método de PCR convencional y no requiere equipo especial.
Esta tecnología se ha utilizado para el diagnóstico rápido de enfermedades tan pronto como apareció, y muchas empresas actualmente utilizan este método en kits de detección de ARN.
Aunque la amplificación de ARN también puede utilizar la tecnología de PCR de transcripción inversa, NASBA tiene sus propias ventajas: se puede llevar a cabo en condiciones de temperatura relativamente constantes y es más estable y precisa que la tecnología de PCR tradicional.
La reacción es a 41 grados centígrados y requiere transcriptasa inversa AMV (virus de la mieloblastosis aviar), RNasa H, ARN polimerasa T7 y un par de cebadores para completarse.
El proceso incluye principalmente:
El cebador directo contiene la secuencia complementaria del promotor T7.Durante la reacción, el cebador directo se une a la cadena de ARN y es catalizado por la enzima AMV para formar una doble cadena de ADN-ARN.
La RNasa H digiere el ARN en la doble hebra híbrida y retiene el ADN monocatenario.
Bajo la acción del cebador inverso y la enzima AMV, se forma una cadena doble de ADN que contiene la secuencia del promotor T7.
Bajo la acción de la polimerasa de ARN T7, se completa el proceso de transcripción y se produce una gran cantidad de ARN diana.
Ventajas de NASBA:
(1) Su cebador tiene una secuencia promotora T7, pero el ADN extraño de doble cadena no tiene una secuencia promotora T7 y no se puede amplificar, por lo que esta tecnología tiene una alta especificidad y sensibilidad.
(2) NASBA incorpora directamente el proceso de transcripción inversa en la reacción de amplificación, acortando el tiempo de reacción.
Desventajas de NASBA:
(1) Los componentes de la reacción son más complicados.
(2) Se requieren tres tipos de enzimas para que la reacción cueste más.
Hora de publicación: 06-ago-2021
