El valor Ct es la forma de presentación de resultados más importante de la PCR cuantitativa fluorescente.Se utiliza para calcular las diferencias de expresión génica o el número de copias de genes.Entonces, ¿cuál es el valor Ct de la cuantificación de fluorescencia que se considera razonable?¿Cómo garantizar el rango efectivo del valor Ct?
¿Qué es el valor Ct?
Durante el proceso de amplificación de qPCR, el número correspondiente de ciclos de amplificación (Umbral de ciclo) cuando la señal de fluorescencia del producto amplificado alcanza el umbral de fluorescencia establecido.C significa Ciclo y T significa Umbral.En pocas palabras, el valor de Ct es el número de ciclos correspondientes a cuando la amplificación de la plantilla inicial alcanza una cierta cantidad de producto en qPCR.La llamada “una cierta cantidad de producto” se explicará más adelante.
¿Qué hace el valor Ct?
1. Relación entre amplificación exponencial, cantidad de plantilla y valor Ct
Idealmente, los genes en qPCR se acumulan mediante amplificación exponencial después de un cierto número de ciclos.La relación entre el número de ciclos de amplificación y la cantidad de productos es: Cantidad de producto amplificado = cantidad de plantilla inicial × (1+En) número de ciclos.Sin embargo, la reacción de qPCR no siempre se encuentra en una situación ideal.Cuando la cantidad de producto amplificado alcanza una "cantidad de producto determinada", el número de ciclos en este momento es el valor Ct y se encuentra en el período de amplificación exponencial.La relación entre el valor Ct y la cantidad de plantilla inicial: existe una relación lineal entre el valor Ct de la plantilla y el logaritmo del número de copia inicial de la plantilla.Cuanto mayor sea la concentración de plantilla inicial, menor será el valor de Ct;cuanto menor sea la concentración de plantilla inicial, mayor será el valor de Ct.
2. Curva de amplificación, umbral de fluorescencia y cierta cantidad de producto de PCR
La cantidad de producto de amplificación de qPCR se presenta directamente en forma de señal fluorescente, es decir, la curva de amplificación.En la etapa inicial de la PCR, la amplificación se realiza en condiciones ideales, el número de ciclos es pequeño, la acumulación de producto es pequeña y el nivel de fluorescencia no se puede distinguir claramente del fondo de fluorescencia.Después de eso, la fluorescencia aumenta y entra en la fase exponencial.La cantidad de producto de PCR se puede detectar en un punto determinado cuando la reacción de PCR está justo en la fase exponencial, que se puede usar como "una cierta cantidad de producto", y el contenido inicial de la plantilla se puede deducir de esto.Por tanto, la intensidad de la señal de fluorescencia correspondiente a una determinada cantidad de producto es el umbral de fluorescencia.
En la última etapa de la PCR, la curva de amplificación ya no muestra una amplificación exponencial y entra en la fase lineal y la fase de meseta.
3.Reproducibilidad de los valores de Ct
Cuando el ciclo de PCR alcanza el número de ciclo del valor Ct, acaba de entrar en el verdadero período de amplificación exponencial.En este momento, el pequeño error no se ha amplificado, por lo que la reproducibilidad del valor de Ct es excelente, es decir, se amplifica la misma plantilla en diferentes tiempos o en diferentes tubos al mismo tiempo.Amplificación, el valor de Ct obtenido es constante.
1.Eficiencia de amplificación Es
La eficiencia de amplificación por PCR se refiere a la eficiencia con la que la polimerasa convierte el gen a amplificar en un amplicón.La eficiencia de amplificación cuando una molécula de ADN se transforma en dos moléculas de ADN es del 100%.La eficiencia de amplificación se expresa comúnmente como En.Para facilitar el análisis de los artículos posteriores, se introducen brevemente los factores que afectan la eficiencia de la amplificación.
| Factores de influencia | explicación | ¿Cómo juzgar? |
| A. Inhibidores de PCR | 1. El ADN molde contiene sustancias que inhiben la reacción de PCR, como proteínas o detergentes.2. El ADNc después de la transcripción inversa contiene una alta concentración de ARN molde o componentes reactivos de RT, que también pueden inhibir la reacción de PCR posterior. | 1. Se puede determinar si hay contaminación midiendo la proporción de A260/A280 y A260/A230 o electroforesis de ARN.2. Si el cDNA se diluye según una cierta proporción después de la transcripción inversa. |
| B. Diseño de imprimación inadecuado | Los imprimadores no se recocen de manera eficiente | Revise los cebadores en busca de dímeros de cebador u horquillas, desajustes y, a veces, diseños intrónicos que se extienden. |
| C. Diseño inadecuado del programa de reacción de PCR | 1. Los imprimadores no pueden recocerse de manera efectiva2. Liberación insuficiente de ADN polimerasa 3. Disminución de la actividad de la polimerasa de ADN a alta temperatura a largo plazo | 1. La temperatura de recocido es superior al valor de TM de la imprimación2. El tiempo de predesnaturalización es demasiado corto 3. El tiempo de cada etapa del procedimiento de reacción es demasiado largo. |
| D. Mezcla insuficiente de reactivos o errores de pipeteo | En el sistema de reacción, la concentración local de los componentes de la reacción de PCR es demasiado alta o desigual, lo que da como resultado una amplificación no exponencial de la amplificación de PCR. | |
| E. Longitud del amplicón | La longitud del amplicón es demasiado larga, superior a 300 pb, y la eficiencia de amplificación es baja | Verifique que la longitud del amplicón esté entre 80-300 pb |
| F. Influencia de los reactivos de qPCR | La concentración de ADN polimerasa en el reactivo es baja o la concentración de iones en el tampón no está optimizada, lo que hace que la actividad de la enzima Taq no alcance el máximo | Determinación de la eficiencia de amplificación por curva estándar |
2.Rango de valores Ct
Los valores de Ct oscilan entre 15 y 35.Si el valor de Ct es inferior a 15, se considera que la amplificación está dentro del rango del período de referencia y no se ha alcanzado el umbral de fluorescencia.Idealmente, existe una relación lineal entre el valor de Ct y el logaritmo del número de copia inicial de la plantilla, es decir, la curva estándar.A través de la curva estándar, cuando la eficiencia de amplificación es del 100%, el valor de Ct calculado para cuantificar el número de copias únicas del gen es de alrededor de 35. Si es superior a 35, el número de copias inicial de la plantilla es teóricamente inferior a 1, lo que puede considerarse sin sentido.
Para diferentes rangos de Ct de genes, debido a la diferencia en el número de copias del gen y la eficiencia de amplificación en la cantidad de plantilla inicial, es necesario hacer una curva estándar para el gen y calcular el rango de detección lineal del gen.
3. Factores que influyen en el valor de Ct
A partir de la relación entre el número de ciclos de amplificación y la cantidad de producto: cantidad de producto amplificado = cantidad de plantilla inicial × (1+En) número de ciclo, se puede ver que, en condiciones ideales, la cantidad de plantilla inicial y En tendrán un impacto negativo en el valor de Ct.La diferencia en la calidad de la plantilla o la eficiencia de la amplificación hará que el valor de Ct sea demasiado grande o demasiado pequeño.
4. El valor de Ct es demasiado grande o demasiado pequeño
Hora de publicación: 22-feb-2023
