La característica sobresaliente de la reacción de PCR es su gran capacidad de amplificación y su sensibilidad extremadamente alta.Para mejorar el rendimiento de la PCR y la eficiencia de detección, estamos comprometidos a mejorar la capacidad de amplificación de la PCR y la sensibilidad de detección, pero el dolor de cabeza está en el proceso del experimento.A menudo se producen falsos positivos y una cantidad muy pequeña de contaminación cruzada de muestras o contaminación del producto de PCR puede causar falsos positivos en el experimento.
Cinco tipos de contaminación de productos de PCR
Hay muchas razones para la contaminación por PCR, que se pueden dividir aproximadamente en las siguientes categorías:
La contaminación del espécimen es causada principalmente por la contaminación del recipiente para recolectar el espécimen, o cuando se coloca el espécimen, se filtra fuera del recipiente debido a un sellado flojo, o el espécimen se adhiere al exterior del recipiente, lo que provoca contaminación cruzada;La contaminación conduce a la contaminación entre especímenes;algunas muestras microbianas, especialmente los virus, pueden propagarse con aerosoles o formar aerosoles, lo que da como resultado una contaminación mutua.
La razón principal es que durante la preparación de los reactivos de PCR, la pistola de muestra, el recipiente, el agua bidestilada y otras soluciones se contaminan con la plantilla de ácido nucleico de PCR.
En los laboratorios de biología molecular y algunos laboratorios que utilizan plásmidos clonados como controles positivos, el problema de la contaminación por plásmidos clonados también es común.Debido a que el contenido de plásmido de clonación en la unidad de volumen es bastante alto, y se necesitan más herramientas y reactivos en el proceso de purificación, y es muy probable que el plásmido en las células vivas esté contaminado debido a la fuerte capacidad de crecimiento y reproducción de las células vivas.
La contaminación de los productos amplificados es el problema de contaminación más común en las reacciones de PCR.Debido a que la cantidad de copias del producto de PCR es grande (generalmente 1013 copias/ml), que es mucho mayor que el límite del número de copias de detección de PCR, una cantidad muy pequeña de contaminación del producto de PCR puede causar falsos positivos.
La contaminación por aerosoles es la forma más probable de contaminación de los productos de PCR y también es la más fácil de pasar por alto.Se forma por la fricción entre la superficie del líquido y el aire.En general, la contaminación por aerosol se puede formar cuando se abre la tapa, cuando se aspira la muestra o incluso cuando se agita vigorosamente el tubo de reacción.Según los cálculos, una partícula de aerosol puede contener 48.000 copias, por lo que la contaminación que provoca es un problema que merece especial atención.
En particular, los laboratorios de pruebas a menudo usan el mismo par de cebadores para probar un determinado gen.Con el tiempo, se producirá una gran cantidad de contaminación de productos de PCR en el espacio del laboratorio.Una vez que se produce dicha contaminación, es difícil eliminarla en poco tiempo.
Para los primeros tres tipos de contaminación, podemos usar medios efectivos para evitarlos, pero la contaminación causada por los productos de PCR es difícil de prevenir, especialmente en la construcción de laboratorios de PCR no estándar.En el proceso de PCR, cuando la punta de la pipeta succiona y sopla el líquido y se abre la tapa del tubo de PCR, se forma un aerosol.Las moléculas de ADN transportadas por el aerosol (un aerosol puede transportar decenas de miles de ADN) son difíciles de eliminar porque flotan en el aire.Una vez que se introduzca la siguiente ronda de experimentos de PCR, inevitablemente se producirán falsos positivos.
Como se muestra en la siguiente figura, el control negativo también amplificó la correspondiente banda de interés:
Aquí se presenta la primera parte de este número de contaminación y prevención de PCR.El próximo número les traerá la segunda parte "Prevención de la contaminación de productos de PCR", ¡así que estén atentos!
Fecha de publicación: 25-jul-2017
