RNasa es una palabra sensible que muchos estudiantes que a menudo realizan experimentos de extracción de ARN no quieren escuchar.Completamente armado, se degradó el ARN que finalmente se extrajo con los reactivos altamente tóxicos fenol y cloroformo.¡No estoy reconciliado!!!Hoy, echemos un vistazo al origen del famoso Rnase.

La ribonucleasa (RNasa), o RNasa, es una nucleasa que puede hidrolizar el ARN en moléculas pequeñas.La RNasa, como proteína de molécula pequeña, es inusualmente estable .La esterilización por vapor convencional a alta temperatura y alta presión y los inhibidores de proteínas no pueden inactivarlo por completo.La estabilidad de la RNasa proviene principalmente de los enlaces disulfuro en la estructura.Por ejemplo, la RNasa de páncreas bovino comúnmente utilizada tiene solo 124 aminoácidos, pero contiene 4 enlaces disulfuro.El enlace de azufre y el enlace de disulfuro dotan a la RNasa de una excelente estabilidad térmica.Además, la masa tiene un peso molecular relativamente pequeño y puede restaurar rápidamente su conformación original en muchos casos.

Además de ser extremadamente estable,Las RNasas son ubicuas en el laboratorio. .La RNasa es un mecanismo de defensa biológico.Para una célula, el ARN exógeno suele ser fatal.En comparación con el ADN exógeno, el ARN exógeno suele ser más peligroso.El ARN se transcribe y traduce felizmente, por lo que casi todos los organismos han desarrollado ARNasas para defenderse de la invasión de ARN exógeno.Por lo tanto, las células bacterianas cultivadas en el laboratorio y las que extraen el ARN exudan el aroma de la ARNasa.Los fluidos corporales humanos (saliva, lágrimas, etc.) contienen una gran cantidad de RNasa, así que no llores cuando el ARN se degrade.¡Cuanto más lloras, peor es la degradación del ARN!!¡La hermana Daiyu no es adecuada para la extracción de ARN!

Además, su delicada piel también contiene mucha RNasa, y los marcadores, pipetas, puertas de refrigeradores y manijas de las puertas que han estado en contacto con la piel también contienen RNasa.

Con tantas divagaciones, echemos un vistazo a cómo lidiar con las RNasas.

Lo primero en lo que todos piensan cuando eliminan el ARN esDEPC(pirocarbonato de dietilo).DEPC desnaturaliza principalmente la proteína al combinarse con el anillo de imidazol del grupo histidina activo de la ARNasa, lo que inhibe la actividad de la enzima.El DEPC al 0,1% puede tener un mejor efecto de eliminación de Rnase, pero debemos prestar atención a que el DEPC es un carcinógeno conocido, por lo que se debe prestar especial atención al usarlo.

Para la RNasa, debemos partir de dos aspectos,el primero es inhibir la actividad de la RNasa endógena

Los reactivos de extracción de ARN convencionales, como el isotiocianato de guanidina y el DTT contenidos en Trizol, pueden abrir el enlace disulfuro de la RNasa, pero todavía hay algunas RNasas, especialmente en muestras de tejido, así que preste atención a las bajas temperaturas.

1.Inmediatamente sumerja la muestra de tejido en nitrógeno líquido después de sacarla, o en una solución comercial de conservación de ARN.

2.Después de extraer el ARN de la muestra de células, agréguelo a la solución de lisis y líselo en la caja de hielo.

3. Es mejor usar nitrógeno líquido para moler cuando las muestras de tejido se homogeneizan.Cuando utilice un homogeneizador eléctrico sin nitrógeno líquido, preste atención a preenfriar completamente el adaptador de homogeneizado.

La segunda es ADNasa exógena.

1.Esté completamente armado, use una bata de laboratorio, use una máscara y asegúrese de usar un par de guantes nuevos (¡no sea tan ahorrativo! Cabe señalar que Trizol es súper corrosivo y también es muy fuerte a través de los guantes, así que no gotee en sus manos).

2.Todas las puntas de pipeta, tubos EP, tubos PCR y otros equipos usados ​​deben ser tratados con desRNasa.Se puede empapar en DEPC al 0,1% y luego presurizar a alta presión.Preste atención a la operación en una campana de humos.Los tiranos locales pueden comprar directamente consumibles para eliminar enzimas.

PD: Déjame decirte un método perezoso.Aunque la alta temperatura y la alta presión no pueden eliminar completamente la ARNasa, eliminarán una gran parte de ella.2 veces de alta temperatura y alta presión tiene un buen efecto, y la extracción de ARN tiene poco efecto.

3.El alcohol puede desnaturalizar las proteínas,para que la mesa de extracción de ARN se pueda limpiar con alcohol al 75 % , y los guantes también se pueden rociar con alcohol.

4.La solución de disolución de ARN final y el tubo de centrífuga también deben tratarse con desRNasa.El agua DEPC es una solución de disolución de ARN de uso común.Hablemos del método de preparación correcto del agua DEPC (recuerde volver a envasar el DEPC comercial cuando lo compre)

Agregue DEPC al agua ultrapura a 1:1000, agite bien, deje reposar durante la noche a 37 °C y esterilice a 121 °C a alta temperatura y alta presión durante 15 minutos.El agua DEPC se puede almacenar a -20 °C en alícuotas de 1 ml.

Finalmente, para resumir: la temperatura baja es la clave, los consumibles se manejan bien, se arman por completo y se habla menos.

Bueno, eso es todo por la estrategia de hoy.Te deseo toda la concentración y pureza del ARN que mencionaste.¡Ambos A260/A280 son 2.0!!!

Por supuesto, si utiliza unfuncionamiento a temperatura ambiente kit de extracción de ARN, es posible que no encuentre los problemas anteriores.

La operación a temperatura ambiente, sin agregar DNasa, extrae el ARN total de las células en 11 minutos y extrae el ARN total de tejidos animales o plantas en 30 minutos.

Para obtener muestras de prueba, comuníquese con:overseas@foregene.com

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