Creo que todo el mundo siempre se encontrará con tales o cuales problemas al hacer reacciones de PCR, pero la mayoría de ellos se pueden clasificar en dos problemas principales:

Muy poca amplificación de la plantilla del gen (amplificación);
Demasiada amplificación de genes no diana.
El uso de aditivos es una de las estrategias comunes para resolver estos problemas.Por lo general, el papel de los aditivos tiene dos aspectos:
estructura secundariade genes (estructura secundaria);
Reducir el cebado no específico.
Hoy, el editor le presentará brevemente los aditivos comunes en las reacciones de PCR y sus funciones.
Aditivos que reducen la estructura secundaria
sulfóxido(DMSO)
muestras de genescon alto contenido de GC.Sin embargo, el DMSO también reduce en gran medida la actividad de la polimerasa Taq.Por lo tanto, todos deben equilibrar la accesibilidad de la plantilla y la actividad de la polimerasa.El editor sugiere que puede probar diferentes concentraciones de DSMO, como del 2 % al 10 %, para encontrar la concentración que se adapte a su experimento.
Detergentes no iónicos
Los detergentes no iónicos, como 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 o NP-40, generalmente reducen la estructura secundaria del ADN.Aunque esto puede aumentar la amplificación del gen molde, también causará el problema de la amplificación no específica.Por lo tanto, estos aditivos funcionan bien para reacciones de PCR de bajo rendimiento sin residuos, pero no tan bien para reacciones de PRC relativamente impuras.Otro beneficio de los detergentes no iónicos es la reducción de la contaminación por SDS.Por lo general, durante el proceso de extracción de ADN, SDS se llevará al paso de PCR, lo que inhibe en gran medida la actividad de la polimerasa.Por lo tanto, agregar 0,5 % de Tween-20 o Tween-40 a la reacción puede neutralizar los efectos negativos del SDS.
Betaína_
La betaína puede mejorar la amplificación del ADN al reducir la formación de estructuras secundarias y, por lo general, es una adición "misteriosa" a los kits de PCR comerciales.Si desea usar betaína, debe poner betaína o monohidrato de betaína (Betaine o Betaine mono-hydrate), pero no clorhidrato de betaína (Betaine HCl), ajuste a una concentración final de 1-1.7M.La betaína también puede ayudar a mejorar la especificidad porque elimina la dependencia de la composición del par de bases de la fusión/desnaturalización del ADN.
Aditivos para reducir la imprimación no específica
formamida
La formamida es un aditivo de PCR orgánico de uso común.Puede combinarse con el surco mayor y el surco menor en el ADN, lo que reduce la estabilidad de la doble hélice del ADN maestro y reduce la temperatura de fusión del ADN.La concentración de formamida utilizada en los experimentos de PCR suele ser del 1% al 5%.
tetrametilocloruro amónico( TMAC)
El cloruro de tetrametilamonio puede aumentar la especificidad de la hibridación (especificidad de hibridación) y aumentar la temperatura de fusión del ADN.Por lo tanto, TMAC puede eliminar el cebado no específico y reducir la unión incorrecta de ADN y ARN.Si utilizacebadores degeneradosen la reacción de PCR, recuerde agregar TMAC, que se usa comúnmente en una concentración de 15-100 mM.
Otros aditivos comunes
Además de las dos categorías de aditivos mencionadas anteriormente, existen muchos aditivos comunes en las reacciones de PCR, aunque tienen diferentes funciones, también son muy importantes.
iones de magnesio
El ion magnesio es un cofactor (cofactor) indispensable de la polimerasa, es decir, sin ion magnesio, la polimerasa está inactiva.Sin embargo, demasiados iones de magnesio también pueden afectar la eficiencia de la polimerasa.La concentración de iones de magnesio en cada reacción de PCR variará.Los agentes quelantes (como EDTA o citrato), la concentración de dNTP y las proteínas afectan la concentración de iones de magnesio.Por lo tanto, si tiene problemas con su experimento de PCR, puede intentar cambiar diferentes concentraciones de iones de magnesio, por ejemplo, de 1,0 a 4,0 mM, con un intervalo de 0,5 a 1 mM en el medio.
Vale la pena señalar que varios ciclos de congelación y descongelación pueden conducir a la estratificación de la concentración de la solución de cloruro de magnesio.Por ello, debes disolverlo por completo antes de cada uso, y mezclarlo bien antes de usarlo.
Albúmina de suero bovino(albúmina bovina, BSA)
En los experimentos de química molecular, la albúmina de suero bovino es un aditivo muy común, especialmente en la digestión con enzimas de restricción y los experimentos de PCR.En las reacciones de PCR, la BSA es útil para reducir contaminantes como los compuestos fenólicos.Y también se dice que puede reducir la adherencia de los reactivos a la pared del tubo de ensayo.En la reacción de PCR, normalmente la concentración de BSA añadida puede alcanzar los 0,8 mg/ml.
 
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