La verificación del rendimiento de los cebadores y las sondas en la etapa inicial de los reactivos de PCR y la determinación de las condiciones de reacción más adecuadas son los requisitos previos para garantizar el progreso sin problemas de los experimentos formales.
Entonces, ¿cómo necesitamos confirmar la sonda del cebador en la etapa inicial?
Los principales indicadores son línea base, curva de amplificación, valor ct, eficiencia de amplificación, detección de muestras de baja concentración, CV, etc.
Base
La línea de base es la línea horizontal en la curva de amplificación de PCR.En los primeros ciclos de la reacción de amplificación por PCR, la señal de fluorescencia no cambia mucho y forma una línea recta.Esta línea recta es la línea base.
Cuando evalúe las sondas de cebador de PCR, preste atención a si la línea de base está nivelada.La pureza de la concentración de la sonda del cebador afectará la línea de base, por ejemplo, haciendo que la línea de base suba o baje.La línea de base también es un indicador muy intuitivo.
Curva de amplificación
Otro indicador intuitivo es la forma de la curva de amplificación.Lo mejor es tener una curva en forma de S para evitar la amplificación secundaria u otras curvas de amplificación anormales.
Valor CT
El número de ciclos correspondiente al punto de inflexión desde la línea de base hasta el crecimiento exponencial es el valor Ct.
Para la misma muestra, diferentes sondas de cebador dan como resultado diferentes curvas de amplificación, y el valor de Ct correspondiente se verá afectado por la eficiencia de amplificación y el grado de interferencia.En teoría, cuanto menor sea el valor de Ct de la sonda de cebador que elijamos, mejor.
Eficiencia de amplificación
Uno de los métodos más confiables y estables para evaluar la eficiencia de la amplificación por PCR es la curva estándar, que también es ampliamente reconocida por los investigadores.El método consiste en hacer una serie de muestras para controlar el número relativo de plantillas objetivo.Estas muestras generalmente se elaboran mediante diluciones en serie de soluciones madre concentradas, la más utilizada es la dilución de 10 veces.Usando una serie de muestras diluidas, usando el programa qPCR estándar para amplificar para obtener el valor de Cq, y finalmente dibujar una curva estándar de acuerdo con la concentración de cada muestra y el valor de Cq correspondiente para obtener la ecuación lineal Cq= -klgX0+b, y la eficiencia de amplificación E=10(-1 /k)-1.Cuando se usa qPCR para análisis cuantitativo, se requiere que la eficiencia de amplificación esté en el rango de 90%-110% (3.6>k>3.1).
Detección de muestras de baja concentración
Cuando la concentración de la muestra es baja, las tasas de detección de las diferentes sondas de cebador son diferentes.Seleccionamos 20 muestras de baja concentración para replicar, y el sistema cebador-sonda con la tasa de detección más alta es el mejor.
Coeficiente de variación (CV)
Se pueden detectar 10 muestras duplicadas con diferentes sondas de cebador de acuerdo con el estándar de línea del reactivo para la detección de amplificación de ácidos nucleicos.
Reactivos cuantitativos:
Exactitud
La precisión dentro de un lote debe cumplir: el coeficiente de variación (CV,%) del valor logarítmico de la concentración de prueba es ≤5%.Cuando la concentración de la muestra es baja, el coeficiente de variación (CV,%) del logaritmo de la concentración de detección es ≤10%
Reactivos cualitativos:
Exactitud
La precisión dentro de un lote debe cumplir con:
(1) Coeficiente de variación del valor Ct (CV,%) ≤5%
La misma muestra se prueba en paralelo 10 veces, y los resultados de la prueba deben ser consistentes
Hora de publicación: 18-sep-2021
