En la etapa inicial del brote, debido al rápido desarrollo, el diagnóstico rápido de los pacientes sospechosos es la clave para prevenir la COVID-19.Algunos reactivos de detección de ácido nucleico aprobados tienen un tiempo de desarrollo corto y existen problemas como confirmación de rendimiento apresurada, optimización de reactivos insuficiente y grandes diferencias entre lotes;Los problemas de varios laboratorios clínicos en varios aspectos del proceso de detección de ácidos nucleicos también pueden afectar la precisión de los resultados de la detección de ácidos nucleicos.Este artículo se centrará en los vínculos y puntos clave en la detección actual de ácido nucleico del SARS-CoV-2 y analizará los problemas de reexamen falso negativo y positivo de la detección de ácido nucleico de laboratorio y la inconsistencia clínica.

Principios de la detección del ácido nucleico del SARS-CoV-2

El SARS-CoV-2 es un virus de ARN con una secuencia genómica de unos 29 kb, con 10 genes, que puede codificar de forma efectiva 10 proteínas.Los virus están compuestos de ARN y proteínas, y la capa más externa es un revestimiento externo compuesto de lípidos y glicoproteínas.En el interior, la cápside proteica envuelve el ARN en ella, protegiendo así al ARN fácilmente degradable (P1).

P1 Estructura del SARS-COV-2

Los virus invaden las células a través de receptores específicos de la superficie celular para causar infección y utilizan las células huésped para replicarse.

El principio de la detección de ácido nucleico viral es exponer el ARN viral a través de un lisado celular y luego usar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa fluorescente en tiempo real (RT-PCR) para la detección.

La clave del principio de detección es usar cebadores y sondas para lograr la "coincidencia dirigida" de las secuencias de ácidos nucleicos, es decir, encontrar la secuencia de ácidos nucleicos del SARS-CoV-2 que es diferente de otros virus en aproximadamente 30 000 bases (la similitud del ácido nucleico con otros virus) área "baja"), diseñar cebadores y sondas.

Los cebadores y las sondas coinciden en gran medida con la región específica del ácido nucleico del SARS-CoV-2, es decir, la especificidad es muy fuerte.Una vez que el resultado de la amplificación de la RT-PCR fluorescente en tiempo real de la muestra que se va a analizar es positivo, prueba que el SARS-CoV-2 está presente en la muestra.Ver P2.

Pasos P2 de la determinación del ácido nucleico del SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente en tiempo real)

Condiciones y requisitos de laboratorio para la detección de ácido nucleico del SARS-CoV-2

Los laboratorios de pruebas de ácido nucleico son los más ideales para entornos de presión negativa y deben prestar atención al control de la presión, mantener el flujo de aire y eliminar los aerosoles.El personal de pruebas de ácido nucleico debe tener las calificaciones correspondientes, recibir capacitación relevante sobre la reacción en cadena de la polimerasa y aprobar la evaluación.El laboratorio debe estar estrictamente administrado, zonificado en el lugar y el personal irrelevante tiene estrictamente prohibido el ingreso.El área limpia debe ventilarse y desinfectarse en el lugar.Los artículos relevantes se colocan en zonas, los limpios y los sucios se separan, se reemplazan a tiempo y se descontaminan en el lugar.Desinfección de rutina: el desinfectante que contiene cloro es la solución principal para áreas más grandes, y se puede usar alcohol al 75 % para áreas pequeñas.Una buena manera de lidiar con los aerosoles es abrir ventanas para ventilación, y la desinfección del aire también se puede realizar mediante rayos ultravioleta, filtración y desinfección del aire.

Enlaces y parámetros clave de la determinación del ácido nucleico del SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente en tiempo real)

Aunque los laboratorios generalmente prestan mucha atención a la "detección" de ácidos nucleicos, de hecho, la "extracción" de ácidos nucleicos también es uno de los pasos clave para una detección exitosa, que está estrechamente relacionada con la recolección y el almacenamiento de muestras de virus.

En la actualidad, las muestras respiratorias más utilizadas, como los hisopos nasofaríngeos, utilizan el segundo método, que es una solución de inactivación (preservación) preparada a base de extracción de ácido nucleico y solución de lisis.Por un lado, esta solución de preservación de virus puede desnaturalizar la proteína del virus, perder su actividad y dejar de ser infeccioso, y mejorar la seguridad de la etapa de transporte y detección;por otro lado, puede romper directamente el virus para liberar el ácido nucleico, eliminar la enzima que descompone el ácido nucleico y prevenir el virus.El ARN se degrada.

Una solución de muestreo de virus preparada sobre la base de una solución de lisis de extracción de ácido nucleico.Los componentes principales son sales equilibradas, agente quelante del ácido etilendiaminotetraacético, sal de guanidina (isotiocianato de guanidina, clorhidrato de guanidina, etc.), tensioactivo aniónico (dodecano) Sulfato de sodio), tensioactivo catiónico (oxalato de tetradeciltrimetilamonio), fenol, 8-hidroxiquinolina, ditiotreitol, proteinasa K y otros varios o más componentes.En la actualidad, existen muchos tipos de kits de extracción de ácidos nucleicos y se utilizan diferentes reactivos de extracción y purificación de ácidos nucleicos.Incluso si se utiliza el mismo reactivo de extracción y purificación de ácidos nucleicos, los procedimientos de extracción de cada kit son diferentes.

En la actualidad, los productos del kit de detección de ácido nucleico aprobados por la Administración Nacional de Productos Médicos se seleccionan en función de los genes ORF1ab, E y N en el genoma del SARS-CoV-2.Los principios de detección de diferentes productos son básicamente los mismos, pero sus cebadores y diseños de sondas son diferentes.Hay segmentos de un solo objetivo (ORF1ab), segmentos de doble objetivo (ORF1ab, N o E) y segmentos de tres objetivos (ORF1ab, N y E).La diferencia entre detección e interpretación, extracción de ácido nucleico y sistema de reacción de RT-PCR fluorescente en tiempo real debe consultar las instrucciones del kit correspondiente, y se recomienda que los usuarios sigan estrictamente el método de interpretación especificado en las instrucciones del kit para la interpretación.Las regiones comunes, cebadores y secuencias de sondas amplificadas por RT-PCR fluorescente en tiempo real se muestran en P3.

P3 La ubicación del objetivo del amplicón del SARS-CoV-2 en el genoma y la secuencia de cebadores y sondas

Interpretación de los resultados de la determinación del ácido nucleico del SARS-CoV-2 (Real-TIME fluorescente RT-PCR)

El “Plan de prevención y control de la neumonía por infección por SARS-CoV-2 (segunda edición)” aclaró por primera vez los criterios para juzgar los resultados de la amplificación de un solo gen:

1. Ningún Ct o Ct≥40 es negativo;

2. Ct<37 es positivo;

3. El valor Ct de 37-40 es el área de escala de grises.Se recomienda repetir el experimento.Si el resultado de rehacer Ct<40 y la curva de amplificación tiene picos evidentes, la muestra se considera positiva; de lo contrario, es negativa”.

La tercera edición de la guía y la cuarta edición de la guía continuaron con los criterios anteriores.Sin embargo, debido a los diferentes blancos utilizados en los kits comerciales, la mencionada 3ª edición de la guía no dio los criterios para determinar la combinación de blancos, enfatizando que prevalecerán las instrucciones proporcionadas por el fabricante.A partir de la quinta edición de las directrices, se han aclarado dos objetivos, especialmente los criterios de juicio para un solo objetivo que es difícil de juzgar.Es decir, si el laboratorio quiere confirmar que un caso es positivo para la detección de ácido nucleico de SARS-CoV-2, se debe cumplir con 1 de 2 condiciones:

(1) Dos objetivos de SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) en la misma muestra dan positivo mediante RT-PCR fluorescente en tiempo real.Si un solo objetivo es positivo, se requiere un nuevo muestreo y una nueva prueba.Si los resultados de la prueba son Si el único objetivo sigue siendo positivo, se considera positivo.

(2) Dos muestras de RT-PCR fluorescente en tiempo real mostraron un solo objetivo positivo al mismo tiempo o dos muestras del mismo tipo mostraron un solo resultado positivo de la prueba, que puede considerarse positivo.Sin embargo, las pautas también enfatizan que los resultados negativos de las pruebas de ácido nucleico no pueden excluir la infección por SARS-CoV-2.Deben excluirse los factores que pueden causar falsos negativos, incluida la mala calidad de la muestra (muestras respiratorias de la orofaringe y otras partes), la recolección de la muestra demasiado pronto o demasiado tarde, las muestras no se almacenaron, transportaron ni procesaron correctamente, y la tecnología en sí tuvo problemas (variación del virus, inhibición de la PCR), etc.

Causas de falsos negativos en la detección de SARS-CoV-2

El concepto de "falso negativo" en las pruebas de ácido nucleico que se refiere actualmente, a menudo se refiere a "falsos negativos" en los que los resultados de la prueba de ácido nucleico son inconsistentes con las manifestaciones clínicas, es decir, los síntomas clínicos y los resultados de imágenes son altamente sospechosos de COVID-19, pero las pruebas de ácido nucleico siempre son "negativas" muchas veces.El Centro de Laboratorio Clínico de la Comisión Nacional de Salud explicó el “falso negativo” de la prueba del SARS-CoV-2.

(1) Hay una cierta cantidad de virus en las células de la persona infectada.Los datos existentes muestran que después de que el cuerpo está infectado por el virus, el virus ingresa a la garganta a través de la nariz y la boca, luego a la tráquea y los bronquios, y luego llega a los alvéolos.La persona infectada experimentará el período de incubación, síntomas leves y luego el proceso de síntomas graves y diferentes etapas de la enfermedad.Y la cantidad de virus presente en diferentes partes del cuerpo es diferente.

En cuanto a la carga viral de los tipos de células, células epiteliales alveolares (vías respiratorias inferiores) > células epiteliales de las vías respiratorias (vías respiratorias superiores) > fibroblastos, células endoteliales y macrófagos, etc.;del tipo de muestra, líquido de lavado alveolar (el más excelente)>esputo de tos profunda>hisopo nasofaríngeo>hisopo orofaríngeo>sangre.Además, el virus también se puede detectar en las heces.Sin embargo, teniendo en cuenta la conveniencia de la operación y la aceptación de los pacientes, el orden de muestra clínica comúnmente utilizado es hisopado orofaríngeo>hisopado nasofaríngeo>líquido de lavado bronquial (operación compleja) y esputo profundo (generalmente tos seca, difícil de obtener) .

Por lo tanto, la cantidad de virus en las células de la orofaringe o la nasofaringe de algunos pacientes es pequeña o extremadamente baja.Si solo se toman muestras de la orofaringe o la nasofaringe para la prueba, no se detectará el ácido nucleico viral.

(2) No se recolectaron células que contenían virus durante la recolección de muestras, o el ácido nucleico viral no se conservó de manera efectiva.

[① Sitio de recolección inadecuado, por ejemplo, al recolectar hisopos orofaríngeos, la profundidad de recolección no es suficiente, los hisopos nasofaríngeos recolectados no se recolectan profundamente en la cavidad nasal, etc. La mayoría de las células recolectadas pueden ser células libres de virus;

②Los hisopos de muestreo se utilizan incorrectamente.Por ejemplo, se recomiendan fibras sintéticas como fibra de PE, fibra de poliéster y fibra de polipropileno para el material del cabezal del hisopo.Las fibras naturales como el algodón se utilizan en la operación real (fuerte adsorción de proteínas y no es fácil de lavar) y fibras de nailon (mala absorción de agua, lo que lleva a un volumen de muestreo insuficiente);

③Uso incorrecto de tubos de almacenamiento de virus, como el uso indebido de tubos de almacenamiento de plástico de polipropileno o polietileno que son fáciles de absorber ácidos nucleicos (ADN/ARN), lo que resulta en una disminución de la concentración de ácido nucleico en la solución de almacenamiento.En la práctica, se recomienda utilizar plástico de polímero de polietileno-propileno y algunos recipientes de plástico de polipropileno especialmente tratados para almacenar ácidos nucleicos virales.]

[① Sitio de recolección inadecuado, por ejemplo, al recolectar hisopos orofaríngeos, la profundidad de recolección no es suficiente, los hisopos nasofaríngeos recolectados no se recolectan profundamente en la cavidad nasal, etc. La mayoría de las células recolectadas pueden ser células libres de virus;

②Los hisopos de muestreo se utilizan incorrectamente.Por ejemplo, se recomiendan fibras sintéticas como fibra de PE, fibra de poliéster y fibra de polipropileno para el material del cabezal del hisopo.Las fibras naturales como el algodón se utilizan en la operación real (fuerte adsorción de proteínas y no es fácil de lavar) y fibras de nailon (mala absorción de agua, lo que lleva a un volumen de muestreo insuficiente);

③Uso incorrecto de tubos de almacenamiento de virus, como el uso indebido de tubos de almacenamiento de plástico de polipropileno o polietileno que son fáciles de absorber ácidos nucleicos (ADN/ARN), lo que resulta en una disminución de la concentración de ácido nucleico en la solución de almacenamiento.En la práctica, se recomienda utilizar plástico de polímero de polietileno-propileno y algunos recipientes de plástico de polipropileno especialmente tratados para almacenar ácidos nucleicos virales.]

(4) El funcionamiento del laboratorio clínico no está estandarizado.Las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras, el funcionamiento estandarizado de los laboratorios clínicos, la interpretación de los resultados y el control de calidad son los factores clave para garantizar la precisión y la fiabilidad de los resultados de las pruebas.De acuerdo con los resultados de la evaluación externa de calidad realizada por el Centro de Laboratorio Clínico de la Comisión Nacional de Salud del 16 al 24 de marzo de 2020, de los 844 laboratorios que recibieron resultados válidos, 701 (83,1%) estaban calificados y 143 (16,9%) no.Calificado, las condiciones generales de las pruebas de laboratorio son buenas, pero los diferentes laboratorios aún tienen diferencias en la capacidad de operación del personal, la capacidad de interpretación de muestras positivas de un solo objetivo y el control de calidad.

¿Cómo reducir el falso negativo de la detección de ácido nucleico del SARS-CoV-2?

La reducción de falsos negativos en la detección de ácidos nucleicos debe optimizarse a partir de los cuatro aspectos de la producción de falsos negativos.

(1) Hay una cierta cantidad de virus en las células de la persona infectada.La concentración del virus en diferentes partes del cuerpo de personas sospechosas de estar infectadas será diferente en diferentes momentos.Si no hay faringe, puede estar en líquido de lavado bronquial o heces.Si se pueden recolectar varios tipos de muestras al mismo tiempo o en diferentes etapas de progresión de la enfermedad para la prueba, ayudará a evitar falsos negativos.

(2) Las células que contienen virus deben recolectarse durante la recolección de muestras.Este problema puede resolverse en gran medida fortaleciendo la capacitación de los recolectores de muestras.

(3) Reactivos IVD fiables.Al llevar a cabo investigaciones sobre la evaluación del rendimiento de detección de los reactivos a nivel nacional y discutir los problemas existentes, se puede mejorar aún más la eficiencia de detección de los reactivos y se puede mejorar la sensibilidad del análisis.

(4) Operación estandarizada de laboratorios clínicos.Al fortalecer la capacitación del personal de laboratorio, mejorar continuamente el sistema de gestión de calidad del laboratorio, garantizar divisiones razonables y mejorar la capacidad de detección del personal, es posible reducir los falsos negativos debido a operaciones de laboratorio inadecuadas.

Motivos de re-test positivo de ácido nucleico SARS-CoV-2 en pacientes recuperados y dados de alta

El “Plan de Diagnóstico y Tratamiento COVID-19 (Trial Seventh Edition)” establece claramente que uno de los criterios para que los pacientes con COVID-19 sean curados y dados de alta del hospital es que dos muestras consecutivas de vías respiratorias tengan una prueba de ácido nucleico negativa (al menos con 24 horas de diferencia), pero son muy pocas. La prueba de ácido nucleico del SARS-CoV-2 volvió a dar positivo en pacientes dados de alta por diversas razones.

(1) El SARS-CoV-2 es un virus nuevo.Es necesario comprender mejor su mecanismo patogénico, el cuadro completo de la enfermedad causada y las características del curso de la enfermedad.Por ello, por un lado, es necesario reforzar el manejo de los pacientes dados de alta y realizar observación médica durante 14 días.Realizar seguimiento, vigilancia y orientación sanitaria para profundizar en el conocimiento de todo el proceso de aparición, desarrollo y evolución de la enfermedad.

(2) El paciente puede volver a infectarse con el virus.El académico Zhong Nanshan dijo: Debido a que los pacientes curados tienen anticuerpos, los anticuerpos pueden eliminar el SARS-CoV-2 cuando invaden nuevamente.Hay muchas razones, que pueden ser la causa del paciente recuperado, o puede estar relacionado con la mutación del virus, o incluso la causa de las pruebas de laboratorio.Si es el propio virus, la mutación del SARS-CoV-2 puede hacer que el anticuerpo producido por el paciente recuperado sea ineficaz contra el virus mutado.Si el paciente vuelve a infectarse con el virus mutado, la prueba de ácido nucleico puede volver a ser positiva.

(3) En lo que respecta a los métodos de prueba de laboratorio, cada método de prueba tiene sus limitaciones.La detección del ácido nucleico del SARS-CoV-2 se debe a la elección de la secuencia del gen, la composición de los reactivos, la sensibilidad del método y otras razones, lo que lleva a que los kits existentes tengan sus propios límites de detección más bajos.Después de que el paciente es tratado, el virus en el cuerpo disminuye.Cuando la carga viral en la muestra a analizar está por debajo del límite inferior de detección, aparecerá un resultado "negativo".Sin embargo, este resultado no significa que el virus en el cuerpo haya desaparecido por completo.El virus puede ser después de que se detiene el tratamiento.Resurgimiento”, continúa copiando.Por lo tanto, se recomienda revisar una vez por semana dentro de las 2 a 4 semanas posteriores al alta.

(4) El ácido nucleico es el material genético del virus.El virus muere después de que el paciente se somete a un tratamiento antiviral, pero los fragmentos restantes de ARN viral aún se retienen en el cuerpo humano y no se eliminan por completo del cuerpo.A veces, bajo ciertas circunstancias, se puede retener más.Mucho tiempo, y en este momento la prueba de ácido nucleico será positiva "transitoria".Con la extensión del tiempo de recuperación del paciente, después de que los fragmentos de ARN residuales en el cuerpo se agoten gradualmente, el resultado de la prueba de ácido nucleico puede volverse negativo.

(5) El resultado de la prueba de ácido nucleico del SARS-CoV-2 solo prueba la presencia o ausencia de ARN viral y no puede probar la actividad del virus y si el virus es transmisible.Es necesario comprobar si un paciente que vuelve a dar positivo en la prueba de ácido nucleico volverá a ser foco de infección.Es necesario realizar cultivo de virus en muestras clínicas y cultivar un virus “vivo” para demostrar que es infeccioso.

Resumen

En resumen, los falsos negativos de la prueba de ácido nucleico del SARS-CoV-2, los positivos repetidos y otras condiciones que son inconsistentes con las manifestaciones clínicas no se pueden evitar por completo.En la detección y las pruebas reales, se recomienda combinar los síntomas clínicos, los exámenes de imágenes (TC) y los resultados de las pruebas de laboratorio (prueba de ácido nucleico + prueba de anticuerpos específicos del virus) para un diagnóstico integral para evitar diagnósticos erróneos y erróneos.Si se determina que los resultados de la prueba son obviamente inconsistentes con las manifestaciones clínicas, se recomienda realizar un análisis exhaustivo de todo el enlace de la prueba (recolección de muestras, circulación y enlaces de procesamiento) para excluir la posibilidad de una infección temprana del virus SARS-CoV-2, una infección recurrente o combinada con otras infecciones por virus respiratorios, etc.Si las condiciones lo permiten, se recomienda recolectar muestras más sensibles, como esputo o líquido de lavado alveolar, para volver a examinarlas.

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