La PCR en tiempo real, también conocida como PCR cuantitativa o qPCR, es un método para monitorear y analizar en tiempo real los productos de amplificación de la PCR.
Debido a que la PCR cuantitativa tiene las ventajas de una operación simple, rápida y conveniente, alta sensibilidad, buena repetibilidad y baja tasa de contaminación, se usa ampliamente en pruebas médicas, evaluación de eficacia de medicamentos, investigación de expresión génica, investigación transgénica, detección de genes, detección de patógenos, detección de animales y plantas., pruebas de alimentos y otros campos.
Por lo tanto, ya sea que se dedique a la investigación básica en ciencias de la vida, o sea empleado de compañías farmacéuticas, compañías de cría de animales, compañías de alimentos o incluso empleados de oficinas de inspección y cuarentena de entrada y salida, departamentos de monitoreo ambiental, hospitales y otras unidades, estará más o menos expuesto o necesita conocer el conocimiento para dominar la PCR cuantitativa.

Principio de la PCR en tiempo real

Real Time PCR es un método en el que se agregan sustancias fluorescentes al sistema de reacción de PCR, y la intensidad de la señal de fluorescencia en el proceso de reacción de PCR se controla en tiempo real mediante un instrumento de PCR cuantitativa y, finalmente, los datos experimentales se analizan y procesan.

【Curva de amplificación】es la curva que describe el proceso dinámico de PCR.La curva de amplificación de la PCR no es en realidad una curva exponencial estándar, sino una curva sigmoidea.

[Fase de plataforma de la curva de amplificación]Con el aumento del número de ciclos de PCR, la inactivación de la ADN polimerasa, el agotamiento de dNTP y cebadores, y la inhibición de la reacción de síntesis por el subproducto de reacción pirofosfato, etc., la PCR no siempre se expande exponencialmente., y eventualmente entrará en una meseta.

[Región de crecimiento exponencial de la curva de amplificación]Aunque la fase de meseta varía mucho, en cierta región de la región de crecimiento exponencial de la curva de amplificación, la repetibilidad es muy buena, lo que es muy importante para el análisis cuantitativo de la PCR.

[Valor umbral y valor Ct]Establecemos el valor límite de detección de fluorescencia en la posición adecuada en el área de crecimiento exponencial de la curva de amplificación, es decir, el valor umbral (Umbral).La intersección del valor de umbral y la curva de amplificación es el valor de Ct, es decir, el valor de Ct se refiere al número de ciclos (Threshold Cycle) cuando se alcanza el valor de umbral.

El siguiente gráfico muestra claramente la relación entre la línea del umbral y la curva de amplificación, el umbral y el valor Ct.

【¿Cómo cuantificar?】

Se ha demostrado por teoría matemática que el valor de Ct tiene una relación lineal inversa con el logaritmo del número de plantillas iniciales.Real Time PCR monitorea los productos de amplificación de PCR en tiempo real y los cuantifica durante la fase de amplificación exponencial.

Para cada ciclo de PCR, el ADN aumentó exponencialmente 2 veces y pronto alcanzó una meseta.

Suponiendo que la cantidad de ADN inicial es A₀ , después de n ciclos, la cantidad teórica de producto de ADN se puede expresar como:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Entonces, cuanto mayor sea la cantidad inicial de ADN A 0, antes alcanzará la cantidad del producto amplificado el valor de detección An , y el número de ciclos hasta llegar a An es el valor Ct.Es decir, cuanto mayor sea la cantidad inicial de ADN A0, antes alcanzará su punto máximo la curva de amplificación y, en consecuencia, menor será el número requerido de ciclos n.

Realizamos una dilución en gradiente del estándar de concentración conocida y lo usamos como plantilla para Real Time PCR, y se obtendrán una serie de curvas de amplificación a intervalos iguales en el orden de cantidad de ADN inicial de más a menos.De acuerdo con la relación lineal entre el valor de Ct y el logaritmo del número de plantillas iniciales, un[curva estándar] se puede crear.

Al sustituir el valor Ct de la muestra con concentración desconocida en la curva estándar, se puede obtener la cantidad de plantilla inicial de la muestra con concentración desconocida, que es el principio cuantitativo de la PCR en tiempo real.

Método de detección de Real Time PCR

Real Time PCR detecta productos de amplificación de PCR al detectar la intensidad de fluorescencia en el sistema de reacción.

Principio del método de incrustación de tinte fluorescente】

tintes fluorescentes, como TB Green ® , puede unirse de forma no específica al ADN de doble cadena en los sistemas de PCR y emitir fluorescencia tras la unión.

La intensidad de la fluorescencia en el sistema de reacción aumentó exponencialmente con el aumento de los ciclos de PCR.Mediante la detección de la intensidad de la fluorescencia, la cantidad de amplificación de ADN en el sistema de reacción se puede monitorear en tiempo real, y luego se puede estimar inversamente la cantidad de la plantilla inicial en la muestra.

【Principio del método de la sonda fluorescente】

sonda fluorescentees una secuencia de ácido nucleico con un grupo fluorescente en el extremo 5' y un grupo desactivador en el extremo 3', que puede unirse específicamente a la plantilla.Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el fluoróforo es extinguida por el grupo de extinción y no puede emitir fluorescencia.Cuando la sonda se descompone, la sustancia fluorescente se disociará y emitirá fluorescencia.

Se agrega una sonda fluorescente a la solución de reacción de PCR.Durante el proceso de recocido, la sonda fluorescente se unirá a la posición específica de la plantilla.Durante el proceso de extensión, la actividad exonucleasa 5′→3′ de la enzima PCR puede descomponer la sonda fluorescente hibridada con la plantilla, y la sustancia fluorescente se disocia para emitir fluorescencia.Al detectar la intensidad de fluorescencia de la sonda en el sistema de reacción, se puede lograr el propósito de monitorear la cantidad de amplificación del producto de PCR.

【Selección del método de detección de fluorescencia】

Si se utiliza para distinguir secuencias con alta homología y realizar detección de PCR multiplex, como el análisis de tipificación de SNP, el método de la sonda fluorescente es insustituible.
Para otros experimentos de PCR en tiempo real, se puede utilizar un método de quimera fluorescente simple, fácil y de bajo costo.

sondasEspecificidad fuerte, capaz de PCR multiplex

Defecto

Requisitos de alta especificidad para la amplificación;

PCR multiplex no se puede realizar Necesidad de diseñar sondas específicas, alto costo;

a veces el diseño de la sonda es difícil

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