Autores: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unidad: Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang afiliado a la Universidad Tongji

En la actualidad, el principal tipo de muestra para la detección de ácidos nucleicos de patógenos respiratorios es el frotis faríngeo.Hay muchos tipos de soluciones de conservación de muestras de uso común, todas las cuales deben refrigerarse o congelarse para su transporte y almacenamiento;Es difícil controlar todo el proceso de baja temperatura durante el proceso de recolección y transporte, y es difícil garantizar el control de calidad antes de la prueba de muestra.^[1-2].

La RNasa (RNasa) es una endonucleasa que hidroliza el ARN, principalmente cortando los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos.La molécula de ARNasa es muy estable, hay enlaces disulfuro en la estructura y su actividad no requiere la presencia de cationes divalentes, por lo que la ARNasa no se desnaturaliza fácilmente y es fácil de renaturalizar incluso después de altas temperaturas o el uso de desnaturalizantes.Las RNasas se dividen en endógenas y exógenas.Las RNasas endógenas pueden liberarse al mismo tiempo que se rompen las células.Por lo tanto, eliminar el papel de las RNasas endógenas es un paso muy crítico en el proceso de extracción de ARN.Las RNasas exógenas están ampliamente distribuidas.Las RNasas existen en el aire, la piel humana, el cabello y la saliva, que son razones importantes para la fácil degradación del ARN.^[3].

consulta de datos

CANS-CL02-A009 “Aplicación de Directrices de Acreditación de Calidad y Competencia de Laboratorios Médicos en el Campo del Diagnóstico Molecular” en los requisitos técnicos propone que se formulen estándares de calidad de agua apropiados de acuerdo con la aplicación;Envases herméticos desechables:

ARNasa/Clasificación

(1) ARNasa A

La ribonucleasa A (RNasa A), derivada del páncreas bovino, es una endorribonucleasa que puede atacar específicamente el extremo 3' de los residuos de pirimidina en el ARN, cortando la citosina o el uracilo formado por nucleótidos adyacentes.Enlace fosfodiéster, el producto final de la reacción es un nucleótido de pirimidina 3' y un oligonucleótido con un nucleótido de pirimidina 3' al final.

(2) ARNasa T1

La ribonucleasa T1 (RNasa T1) se deriva de Aspergillus orjzae, actúa específicamente sobre el fosfato 3′-terminal de la guanina, y el sitio de escisión se encuentra entre el fosfato 3′ de la guanina y el hidroxilo 5′ de los nucleótidos adyacentes.El producto final de la reacción es ácido 3'guanílico y fragmentos de oligonucleótidos con ácido 3'guanílico al final.

(3) ARNasa H

La ribonucleasa H (RNasa H) se descubrió por primera vez a partir del tejido del timo de ternero y su gen codificante se ha clonado en Escherichia coli.Puede degradar específicamente cadenas de ADN: ARN en dúplex híbridos de ARN, dando como resultado oligonucleótidos y mononucleótidos con extremos 3'-OH y 5'-monofosfato, no puede degradar ADN o ARN de cadena simple o doble.

ARNasa

Función y uso

La ribonucleasa puede catalizar la degradación del ácido ribonucleico (ARN) y puede sintetizarse artificialmente.El ungüento medicinal se usa tópicamente para tratar traumatismos y dolores articulares.Según los informes, la ribonucleasa puede cambiar el metabolismo de la célula huésped, inhibir la síntesis de virus, inhibir la proliferación del virus de la influenza in vitro e inhibir la formación de virus vaccinia y herpes en embriones de pollo.Uso clínico de la inyección intramuscular diaria de ribonucleasa de 180 mg, beneficiosa para el tratamiento de la encefalitis epidémica, la ribonucleasa puede catalizar la degradación del ácido ribonucleico (ARN) y ahora puede sintetizarse artificialmente.El ungüento medicinal se usa tópicamente para tratar traumatismos y dolores articulares.Según los informes, la ribonucleasa puede cambiar el metabolismo de la célula huésped, inhibir la síntesis de virus, inhibir la proliferación del virus de la influenza in vitro e inhibir la formación de virus vaccinia y herpes en embriones de pollo.El uso clínico de la inyección intramuscular diaria de ribonucleasa de 180 mg es beneficioso para el tratamiento de la encefalitis epidémica.

ARNasa

Definición de inhibidor

Definición de unidad inhibidora de ARNasa: La cantidad de enzima necesaria para inhibir el 50 % de la actividad de 5 ng de ARNasa A es una unidad.

Cómo funcionan los inhibidores de la ARNasa

Isotiocianato de guanidina:

El isotiocianato de guanidina es un compuesto orgánico con la fórmula molecular C2H6N4S.Se utiliza principalmente en medicina biológica, reactivos químicos, etc. El isotiocianato de guanidina es un agente de lisis de proteínas y, a menudo, se usa como componente principal de la solución de lisis en reactivos de diagnóstico molecular.Puede lisar el tejido, destruir la estructura celular y disociar el ácido nucleico de la nucleoproteína, y tiene una fuerte desnaturalización a RNasa.Es el inhibidor de RNasa más eficaz en la actualidad.

TRIzol es un novedoso reactivo de extracción de ARN total que puede extraer directamente el ARN total de células o tejidos.Contiene sustancias como el fenol y el isotiocianato de guanidina, que pueden alterar rápidamente las células e inhibir las nucleasas liberadas por las células.

(Sin embargo, el isotiocianato de guanidina es peligroso para la salud de los investigadores de laboratorio).

RNasina:

Glicoproteína ácida extraída de hígado de rata o blastodermo humano.Rnasin es un inhibidor no competitivo de RNasa, que puede unirse a varias RNasas para inactivarlas.

(Más detalles: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Halta temperatura:

La alta temperatura también es un medio común de desnaturalización de proteínas.

Dietilpirocarbonato (DEPC):

DEPC es un inhibidor fuerte pero incompleto de la RNasa, que puede inhibir la actividad de la RNasa al combinarse con el anillo de aminoácido imidazol del grupo activo de la RNasa para desnaturalizar las proteínas.

Complejo de ribonucleósido de vanadilo:

Un complejo formado por iones de óxido de vanadio y nucleósidos, que se une a la RNasa en forma de sustancias de transición, que pueden inhibir casi por completo la actividad de la RNasa.

otro:

SDS, urea, tierra de diatomeas, etc. también tienen un cierto efecto inhibidor sobre la RNasa.

Reseñas de expertos

Técnico jefe de Li Yujie

Director del Departamento de Laboratorio, Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang Afiliado a la Universidad Tongji

Para evitar la biodegradación de la ARNasa exógena, se deben usar máscaras, guantes y gorros y reemplazarlos con frecuencia durante el proceso de extracción de ARN.Toda la cristalería debe hornearse en un horno de secado a 200°C durante más de 2 horas.Los materiales utilizados para hornear, como el plástico, deben tratarse con agua DEPC y luego lavarse con agua destilada.Los reactivos o dispositivos utilizados para la extracción, conservación e identificación del ARN deben estar dedicados al ARN, y se debe establecer un área de operación de ARN independiente.

referencias:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bacterias y virus en la nasofaringe inmediatamente antes de la aparición de infecciones agudas de las vías respiratorias inferiores en niños indígenas australianos [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Rama de Control de Infecciones Hospitalarias de la Asociación China de Medicina Preventiva.Directrices para la recogida e inspección de muestras microbianas clínicas [J].Revista china de infecciones hospitalarias, 2018(20):3192-3200.

[3] "Prueba clínica diez mil por qué volumen de prueba de biología molecular"