COVID-19 es una enfermedad infecciosa causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus tipo 2. Cuando una persona está infectada, los síntomas más comunes incluyen fiebre, tos y dificultad para respirar.
Las muestras utilizadas para la prueba se pueden recolectar mediante hisopos nasofaríngeos o hisopos orofaríngeos.
¿Qué es PCR?
El método estándar de detección de coronavirus es la reacción en cadena de la polimerasa, PCR.Este es un método ampliamente utilizado en biología molecular.Puede copiar rápidamente de millones a miles de millones de fragmentos de ADN específicos.
El nuevo coronavirus contiene un genoma de ARN monocatenario muy largo.Para detectar estos virus mediante PCR, las moléculas de ARN deben convertirse en sus secuencias de ADN complementarias mediante transcriptasa inversa, y luego el ADN recién sintetizado puede amplificarse mediante procedimientos de PCR estándar, lo que comúnmente se conoce como RT-PCR.
Proceso de RT-PCR
extracción de ARN
Para realizar este método, básicamente se debe extraer el ARN viral.Se puede utilizar una variedad de kits de purificación de ARN para una separación conveniente, rápida y efectiva.
Para extraer el ARN viral con un kit comercial, primero agregue la muestra a un tubo de microcentrífuga y luego mézclela con el tampón de lisis.Este tampón está muy desnaturalizado y normalmente consiste en fenol e isotiocianato de guanidina.Además, los inhibidores de la RNasa suelen estar presentes en el tampón de lisis para garantizar el aislamiento del ARN viral intacto.
Después de agregar el tampón de lisis, agite el tubo mezclador por pulsos e incube a temperatura ambiente.A continuación, el virus se lisa en condiciones altamente desnaturalizantes proporcionadas por el tampón de lisis.
Después de lisar la muestra, se utiliza un tubo de centrífuga para el procedimiento de purificación.La muestra se carga en el tubo de centrífuga y luego se centrifuga.
Este procedimiento es un método de extracción en fase sólida en el que la fase estacionaria consiste en una matriz de gel de sílice.
En condiciones óptimas de sal y pH, las moléculas de ARN se unen a la membrana de sílice.
Al mismo tiempo, se eliminan las proteínas y otros contaminantes.
Después de la centrifugación, coloque el tubo de centrífuga en un tubo de recolección limpio, deseche el filtrado y luego agregue el tampón de lavado.
Vuelva a colocar el tubo en la centrífuga para forzar el tampón de lavado a través de la membrana.Esto eliminará todas las impurezas restantes de la membrana, dejando solo el ARN unido al gel de sílice.
Después de lavar la muestra, coloque el tubo en un tubo de microcentrífuga limpio y agregue el tampón de elución.
Luego se centrifuga para forzar el tampón de elución a través de la membrana.El tampón de elución elimina el ARN viral de la columna giratoria y obtiene ARN purificado libre de proteínas, inhibidores y otros contaminantes.
PASO 2
concentrado mixto
Después de extraer el ARN viral, el siguiente paso es preparar la mezcla de reacción para la amplificación por PCR.En este paso, se utiliza concentrado.Esta solución concentrada es una solución concentrada premezclada que consta de una premezcla, transcriptasa inversa, nucleótidos, cebador directo, cebador inverso, sonda TaqMan y ADN polimerasa.
Finalmente, para completar esta mezcla de reacción, se agrega la plantilla de ARN.Los tubos se mezclan mediante agitación vorticial pulsada y luego la mezcla de reacción se carga en la placa de PCR.La placa de PCR generalmente contiene 96 pocillos y puede analizar múltiples muestras al mismo tiempo.
PASO 3
amplificación por PCR
A continuación, coloque la placa en la máquina PCR, que es esencialmente un termociclador.
La RT-PCR en tiempo real se utiliza para detectar el nuevo coronavirus de 2019 mediante la amplificación de la secuencia objetivo en el gen RdrRP, el gen E y el gen N.La elección del gen diana depende de la secuencia del cebador y la sonda.
El primer paso de la RT-PCR es la transcripción inversa.Se sintetiza la primera hebra de ADN complementario, que es iniciada por el cebador inverso de PCR, que se une a la parte complementaria del genoma de ARN viral.Luego, la transcriptasa inversa agrega nucleótidos de ADN al extremo 3' del cebador para sintetizar ADN complementario al ARN viral.La temperatura y la duración de este paso dependen de los cebadores, el ARN diana y la transcriptasa inversa utilizados.
A continuación, se aplica un paso de desnaturalización inicial, que da como resultado la desnaturalización del híbrido ARN-ADN.Este paso es necesario para activar la ADN polimerasa.Al mismo tiempo, se inactiva la transcriptasa inversa.
La PCR consiste en una serie de ciclos térmicos.Cada ciclo consta de pasos de desnaturalización, recocido y extensión.
El paso de desnaturalización implica calentar la cámara de reacción a 95 grados centígrados y usarla para la desnaturalización de la plantilla de ADN de doble cadena.
En el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 58 grados centígrados, lo que permite que el cebador directo se hibrida con la parte complementaria de su plantilla de ADN monocatenario.La temperatura de recocido depende directamente de la longitud y composición de la imprimación.
En el paso de extensión, la ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN que es complementaria a la hebra molde de ADN.Agregando núcleos libres complementarios a la plantilla en la dirección 5'a 3' de la mezcla de reacción.La temperatura de este paso depende de la ADN polimerasa utilizada.
Después del primer ciclo, se obtiene una diana de ADN de doble cadena.
Luego, ingresa al segundo ciclo.El ADN de doble cadena se desnaturaliza para producir dos moléculas de ADN de cadena sencilla.
En el siguiente paso, se reduce la temperatura de reacción, los cebadores se hibridan con cada plantilla de ADN monocatenario y la sonda Taq-man se hibrida con la parte complementaria del ADN objetivo.
La sonda TaqMan consta de un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda de oligonucleótidos.Cuando es excitado por la fuente de luz del ciclador, el fluoróforo emite fluorescencia.Además, la sonda está compuesta por un extintor en el extremo 3′.La proximidad del gen informador al extintor impide la detección de la fluorescencia.
En el paso de extensión, la ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra.Cuando la polimerasa llega a la sonda TaqMan, su actividad de nucleasa 5' endógena escinde la sonda, separando el tinte del extintor.
Con cada ciclo de PCR, se liberan más moléculas de colorante, lo que da como resultado un aumento en la intensidad de la fluorescencia proporcional al número de amplicones sintetizados.
Este método permite estimar el número de una secuencia dada presente en la muestra.El número de fragmentos de ADN de doble cadena se duplica en cada ciclo.Por lo tanto, la PCR se puede utilizar para analizar muestras muy pequeñas.
Para medir la señal fluorescente, la lámpara halógena de tungsteno, el filtro de excitación, el reflector, la lente, el filtro de emisión y la cámara CCD de uso del dispositivo de carga acoplada.
PASO 4 Detectar
Para medir la señal fluorescente, la lámpara halógena de tungsteno, el filtro de excitación, el reflector, la lente, el filtro de emisión y la cámara CCD de uso del dispositivo de carga acoplada.
La luz filtrada de la lámpara se refleja en el reflector, pasa a través de la lente del condensador y se enfoca en el centro de cada orificio.Luego, la fluorescencia emitida por el orificio se refleja en el espejo, pasa a través del filtro de emisión y es detectada por la cámara CCD.En cada ciclo de PCR, el CCD puede detectar la luz del fluoróforo autoexcitado.
Convierte la luz capturada en datos digitales.Este método se llama PCR en tiempo real y permite monitorear en tiempo real el progreso de la reacción de PCR.
Hora de publicación: 19-jul-2021
