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1. Detectar la absorbancia de la solución de ARN

La absorbancia a 280, 320, 230 y 260 nm representa los valores de ácido nucleico, fondo (turbidez de la solución), concentración de sal y materia orgánica como proteína, respectivamente.Por lo general, solo mire OD260/OD280 (Ratio, R).Cuando está entre 1,8 y 2,0, pensamos que se puede tolerar la contaminación de proteínas u otra materia orgánica en el ARN, pero debe tenerse en cuenta que cuando se utiliza Tris como tampón para detectar la absorbancia, el valor R puede ser superior a 2 (generalmente debería ser <2,2).Cuando R<1.8, la contaminación de proteínas u otra materia orgánica en la solución es más obvia y el destino del ARN se puede determinar según las necesidades.Cuando R>2.2, significa que el ARN se ha hidrolizado en un solo ácido nucleico.
 
2.Patrón electroforético de ARN
Generalmente, el gel desnaturalizante se usa para la electroforesis de ARN, pero si es solo para detectar la calidad del ARN, el gel desnaturalizante no es necesario y se puede usar gel de agarosa común.El propósito de la electroforesis es detectar la integridad de las bandas 28S y 18S y su relación, o la integridad del frotis de ARNm.Generalmente, si las bandas 28S y 18S son brillantes, claras y nítidas (los bordes de las bandas son claros), y el brillo de 28S es más del doble que el de la banda 18S, consideramos que la calidad del ARN es buena.
Los anteriores son los dos métodos que usamos comúnmente, pero ninguno de estos dos métodos puede decirnos claramente si hay RNasa residual en la solución de ARN.Si hay una cantidad muy pequeña de RNasa en la solución, es difícil para nosotros detectarla con el método anterior, pero la mayoría de las reacciones enzimáticas posteriores se llevan a cabo por encima de los 37 grados y durante mucho tiempo.De esta forma, si hay una cantidad muy pequeña de RNasa en la solución de ARN, habrá un entorno y un tiempo muy adecuados para desempeñar su papel en los experimentos posteriores y, por supuesto, el experimento estará frío en este momento.A continuación presentamos un método que puede confirmar si hay RNase residual en la solución de RNA.
 
3. Prueba de conservación del calor
De acuerdo con la concentración de la muestra, extraiga dos ARN de 1000 ng de la solución de ARN y agréguelos a un tubo de centrífuga de 0,5 ml y complételo con tampón Tris de pH 7,0 hasta un volumen total de 10 ul y luego selle la tapa del tubo.Ponga uno de ellos en un baño de agua a temperatura constante a 70°C y manténgalo caliente durante 1 h.La otra parte se almacenó en un refrigerador a -20°C durante 1 h.Cuando se acabe el tiempo, retire las dos muestras para la electroforesis.Después de completar la electroforesis, compare las bandas electroforéticas de los dos.Si las bandas de los dos son consistentes o no tienen una diferencia significativa (por supuesto, sus bandas también cumplen las condiciones del método 2), significa que no hay contaminación residual de ARNasa en la solución de ARN y que la calidad del ARN es muy buena.Por el contrario, si la muestra incubada a 70°C muestra una degradación evidente, indica que hay contaminación por ARNasa en la solución de ARN.
 
2 Métodos y técnicas experimentales para la extracción de ARN
Los problemas que encontramos a menudo al extraer ARN son: (1) el rendimiento de ARN es bajo;(2) el ARN tiene una grave contaminación por sal;(3) el ARN tiene una grave contaminación por disolventes orgánicos;(4) degradación de la muestra y otros problemas
 
1. Reactivos de extracción de ARN total de uso común
El método del isotiocianato de guanidina y el método Trizol son los métodos más utilizados para la extracción de ARN total de tejidos y células animales.Está especialmente indicado para muestras pequeñas y tejidos que son particularmente difíciles de extraer, como la extracción de ARN total de piel de conejo y tejido conectivo animal;además, Trizol, como reactivo de lisis de uso general, también se puede utilizar para la extracción de tejidos vegetales, bacterias, hongos y otros tejidos.Para tejidos vegetales que contienen polisacáridos y polifenoles, como camellia oleifera, hojas de té, colza, etc., el método CTAB también se puede utilizar para extraer el ARN total.

Como método convencional, el método de doble columna también es muy popular debido a su operación a temperatura normal, sin necesidad de agregar RNasa y seguridad: sin cloroformo, fenoles y otros reactivos orgánicos para la extracción.(Productos Recomendados )

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2. Extracción de ARN total de tejidos animales
 
(1) Trate de elegir tejido fresco, si no está fresco (preferiblemente dentro de los tres meses - 80 ℃ refrigerador o congelado en nitrógeno líquido. Al cortar tejido, no corte directamente a temperatura ambiente, asegúrese de ponerlo en la caja de hielo, trate de evitar la congelación y descongelación repetidas.
(2) Use tijeras y pinzas limpias para cortar un pequeño trozo de tejido, intente cortar la parte central del tejido al cortar la muestra, o primero corte el trozo grande de tejido desde el medio y luego corte la muestra en la posición de incisión fresca.El tejido extraído debe triturarse por completo, colocar el tejido triturado en un tubo EP sin RNase, agregar el lisado, el tejido triturado debe exponerse completamente al lisado y prepararse para la homogeneización.

(3) Para tejidos normales, seleccione tejidos del tamaño de un frijol mungo (30-60 mg) para la homogeneización.Si los tejidos contienen una gran cantidad de proteínas, grasas o tejidos fibrosos densos como el hígado, aumente o disminuya adecuadamente la cantidad de tejidos cortados (opcional) Elija 10~20 mg).
(4) Si se extraen músculos de pescado, carne de camarones, medusas y otros tejidos con alto contenido de agua, el volumen de la muestra debe aumentarse adecuadamente (se recomienda 100-200 mg).
(5) Si las condiciones lo permiten, el tejido animal puede extraerse directamente después de ser homogeneizado con un homogeneizador de tejido de paso alto, si no existe dicho equipo.
(6) El ARN obtenido después de la extracción final debe colocarse en la caja de hielo inmediatamente para reducir la degradación del ARN.

3. extracción de ARN de células animales

(1) Células en suspensión: centrifugue directamente y deseche el medio, lave con PBS estéril 1 o 2 veces, luego suspenda con una cantidad apropiada de PBS y luego agregue el lisado para la lisis.No agregue el lisado directamente a las células precipitadas después de desechar completamente el líquido.Esto hará que el paquete de histonas liberado después de que las células lisadas en la capa externa se adhieran al exterior de las células precipitadas, limitando así el contacto de las células dentro del sedimento con el lisado., lo que da como resultado una lisis celular incompleta y un rendimiento de ARN reducido.

(2) Células que son semiadherentes o no muy adherentes: después de desechar el medio, lave con PBS 1 o 2 veces, luego absorba directamente una cantidad apropiada de PBS y sople la placa de cultivo con una pipeta o pistola para eliminar las células y transferirlas a células libres de ARN.Agregue el lisado al tubo EP de la enzima para la extracción.

(3) Células adherentes: primero deben digerirse con tripsina, luego recolectarse en tubos EP sin ARNasa, centrifugarse para eliminar el sobrenadante, lavarse 1 o 2 veces con PBS para eliminar el exceso de tripsina y resuspenderse con una cantidad adecuada de PBS. A continuación, continuar con el paso de extracción.

4. Planta de extracción de ARN

Los tejidos vegetales son ricos en compuestos fenólicos, o ricos en polisacáridos, o contienen algunos metabolitos secundarios no identificados, o tienen alta actividad de RNasa.Estas sustancias se combinan estrechamente con el ARN después de la lisis celular para formar complejos insolubles o precipitados coloidales, que son difíciles de eliminar.Por lo tanto, cuando extraemos tejido vegetal, debemos elegir un kit para plantas.El lisado del kit puede resolver eficazmente los problemas de fácil oxidación de polifenoles y separación de compuestos de polisacáridos y ácidos nucleicos.

(Para la extracción de ARN vegetal de polifenoles polisacáridos, productos recomendados:

(1) La cáscara, la pulpa, las semillas, las hojas, etc. de la planta deben triturarse por completo en un mortero.Durante el proceso de molienda, el nitrógeno líquido debe reponerse a tiempo para evitar la fusión de la muestra.La muestra molida debe agregarse rápidamente al lisado y agitarse para evitar la degradación del ARN.

(2) Para muestras ricas en fibra, como hojas de arroz y trigo, la cantidad de extracción debe reducirse adecuadamente; de ​​lo contrario, la molienda y la lisis del tejido no estarán completas, lo que dará como resultado un bajo rendimiento de ARN extraído.

(3) Para tejidos vegetales con alto contenido de agua, como granada, sandía, melocotón, etc., el tamaño de la muestra debe aumentarse adecuadamente (100-200 mg es opcional).

(4) En general, se recomienda el uso de nitrógeno líquido para los tejidos de plantas, como hojas de plantas, rizomas, frutas duras y otros materiales, para enmasillar completamente los ingredientes en un mortero y luego continuar con el paso de extracción.Los homogeneizadores de tejidos convencionales pueden no ser efectivos para homogeneizar tejidos vegetales y, por lo general, no se recomiendan.

5. Precauciones para la extracción de ARN

(1) Las muestras de tejido deben ser lo más frescas posible para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.

(2) El tejido debe triturarse por completo durante la extracción, y la cantidad de tejido no debe ser demasiado pequeña, y mucho menos demasiado.

(3) Se debe dar suficiente tiempo de incubación después de agregar el lisado para lisar completamente la muestra.

(4) Cuando se utiliza el método Trizol para la extracción, el principio de absorción del sobrenadante después de la estratificación es "preferir inhalar menos que inhalar más", y no debe extraerse hasta la capa intermedia, de lo contrario, se producirá una grave contaminación del ADN genómico.

(5) Al lavar, el líquido de lavado debe infiltrarse por completo alrededor de la pared del tubo para garantizar un lavado completo.

(6) Para el método de extracción en columna, además de separar la columna después del lavado, la columna de adsorción también debe colocarse en un banco ultralimpio y soplarse durante 5 a 10 minutos para evaporar completamente el solvente orgánico hasta sequedad.

(7) En la última elución del método de la columna, después de agregar agua DEPC, debe incubarse durante 3 a 5 minutos, o el agua DEPC debe calentarse a 60 °C por adelantado para aumentar el rendimiento de la elución.En el método tradicional de precipitación con trizol y precipitación con isopropanol, el ARN final se disuelve en agua DEPC, por lo que se debe dar un tiempo adecuado para la disolución y se debe soplar continuamente el fondo del tubo de centrífuga con una punta de pipeta.

3TTres causas y soluciones para baja concentración de ARN/mala calidad
 
1. El rendimiento es demasiado bajo
La muestra extraída es demasiado baja, la cantidad total es insuficiente o la muestra extraída es demasiado y la lisis no está completa;para la extracción se debe utilizar tejido o células de calidad adecuada, el pretratamiento de la muestra debe hacerse bien y la lisis debe ser suficiente.
 
2. Residuos del genoma
Cuando se extrae con el método Trizol, cuando el sobrenadante se succiona hacia la capa intermedia después de la estratificación, se producirá una grave contaminación del genoma;se debe tener especial cuidado al colocar capas para evitar absorber la capa intermedia.Si se utiliza el método de columna para la extracción, se puede seleccionar un kit que contenga ADNasa I para la extracción.El ácido nucleico adsorbido en la membrana se digiere directamente con la ADNasa I, que puede reducir en gran medida los residuos de ADN.
 
3. degradación del ARN
Puede ser la degradación de la propia muestra extraída, o la degradación provocada durante el proceso de extracción;en la medida de lo posible, se deben usar muestras frescas para la extracción de ARN, y las muestras recolectadas se deben almacenar en nitrógeno líquido o en un refrigerador a -80 ° C a tiempo, y se debe evitar la congelación y descongelación repetidas.En el proceso de extracción de ARN se deben utilizar puntas libres de ARNasa/ADNasa, tubos de centrífuga y otros materiales.El proceso de extracción debe ser lo más rápido posible.El ARN extraído debe colocarse en una caja de hielo y almacenarse a -80 en el tiempo.Si es necesario detectar el ARN extraído mediante electroforesis en gel, la electroforesis debe realizarse inmediatamente después de la extracción y el tampón de electroforesis debe reemplazarse por uno recién preparado.
 
4. Residuos de sales y disolventes orgánicos
Los reactivos de extracción contienen sales de fenol y guanidina, y la solución de lavado contiene etanol.Durante el proceso de extracción, el lisado no se absorbió ni se descartó por completo, y la solución de lavado no se secó por completo.Las sales residuales y los disolventes orgánicos son perjudiciales para la transcripción inversa y la PCR posteriores.Diferentes grados de inhibición, por lo que el lisado de tejido debe eliminarse por completo durante el proceso de extracción y el lavado debe ser suficiente para que las paredes circundantes del tubo puedan lavarse.Además, el vaciado y soplado del tubo es un paso necesario, que reducirá aún más el residuo de materia orgánica.
 
Para obtener más información sobre la extracción de ARN, visite nuestro sitio web:
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Hora de publicación: 01-dic-2022