La PCR directa es una reacción que utiliza directamente tejidos animales o vegetales para la amplificación sin extracción de ácido nucleico.En muchos sentidos, la PCR directa funciona como la PCR normal.

La principal diferencia es el tampón personalizado utilizado en la PCR directa, la muestra se puede someter directamente a la reacción de PCR sin extracción de ácido nucleico, pero existen requisitos correspondientes para la tolerancia de las enzimas y la compatibilidad del tampón involucrado en la reacción de PCR directa.

Aunque hay más o menos inhibidores de la PCR en muestras comunes, la PCR directa aún puede lograr una amplificación confiable bajo la acción de enzimas y tampones.La reacción de PCR tradicional requiere ácido nucleico de alta calidad como plantilla, que puede inhibir el progreso sin problemas de la reacción de PCR si la plantilla contiene proteínas y otras impurezas.La PCR directa es actualmente una de las tecnologías más populares en el campo del diagnóstico molecular.

01 La PCR directa se usó originalmente para animales y plantas

La primera aplicación de la PCR directa es en el campo de animales y plantas, como la sangre, el tejido y el pelo de rata, gato, pollo, conejo, oveja, ganado, etc., hojas y semillas de plantas, etc., que se utilizan para estudiar genotipado, transgénico, detección de plásmidos, análisis de eliminación de genes, identificación de fuentes de ADN, identificación de especies, análisis de SNP y otros campos.

Estos campos tienen algunas características comunes, es decir, el contenido de genes objetivo es relativamente alto y la extracción de ácidos nucleicos es problemática, por lo que la PCR directa no solo puede ahorrar tiempo y tener un pequeño impacto en los resultados, sino también ahorrar costos.

La PCR directa utilizada para la detección de patógenos es una cuestión de los últimos años, algunos fabricantes de reactivos de PCR han realizado muchos esfuerzos en esta dirección al realizar innovaciones.Especialmente en esta epidemia de COVID-19, muchos de estos productos de detección han aparecido en el mercado, como el kit de detección de ácido nucleico SARS-CoV-2 (Método de sonda fluorescente de PCR multiplex) investigado y desarrollado por Foregene, que utiliza la tecnología RT PCR en tiempo real (rRT-PCR) para la detección cualitativa de ácidos nucleicos de SARS-CoV-2 en muestras de hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos humanos.

Foregene es una de las empresas que utiliza la tecnología de PCR directa para la detección de ORF1ab, N, E yvariante linajes ácidos nucleicos en muestras de hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos humanos, como el linaje SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Reino Unido), el linaje B.1.351 (ZA), el linaje B.1.617 (IND) y el linaje P.1 (BR).

02  Reactivos necesarios para la PCR directa

Muestra de lisado

El lisado de muestra puede configurarlo usted mismo o comprarlo.La diferencia en la composición de diferentes marcas de lisado hará que la capacidad de lisis sea diferente, y luego el tiempo de lisis será ligeramente diferente.Por ejemplo, para la preparación de muestras de tejido animal, generalmente se recomienda una lisis de 30 minutos o durante la noche, y la solución de lisis para virus oscila entre 3 y 10 minutos.

Mezcla maestra de PCR

Se recomienda utilizar ADN polimerasa de arranque en caliente para mejorar la amplificación específica y aumentar la capacidad de amplificación.El núcleo de la PCR directa es una polimerasa altamente tolerante.

Eliminar o inhibir los componentes de la muestra que afectan la amplificación del ADN

Después de procesar la muestra con el lisado, se liberarán proteínas, lípidos y otros desechos celulares, estas sustancias inhibirán la reacción de PCR.Por lo tanto, la PCR directa requiere la adición de inhibidores de eliminación correspondientes para reducir la influencia de estos factores.

03  Una colección de cinco puntos de conocimiento de PCR directa

Primero, la tecnología Direct PCR es una tecnología de PCR directa para varias muestras biológicas.Bajo esta condición técnica, no hay necesidad de separar y extraer el ácido nucleico, usar directamente la muestra de tejido como objeto y agregar los cebadores del gen objetivo para realizar la reacción de PCR.

En segundo lugar, la tecnología Direct PCR no es solo una tecnología tradicional de amplificación de plantillas de ADN, sino que también incluye PCR de transcripción inversa de plantillas de ARN.

En tercer lugar, la tecnología de PCR directa no solo realiza directamente reacciones de PCR cualitativas de rutina en muestras de tejido, sino que también incluye reacciones de qPCR en tiempo real, lo que requiere que el sistema de reacción tenga una fuerte capacidad de interferencia contra la fluorescencia de fondo y que la fluorescencia endógena extinga la capacidad antagónica.

En cuarto lugar, las muestras a las que se dirige la tecnología de PCR directa solo necesitan la liberación de plantillas de ácido nucleico y no eliminan proteínas, polisacáridos, iones de sal, etc. que interfieren con la reacción de PCR.Lo que requiere que la polimerasa de ácido nucleico y la PCR Mix en el sistema de reacción tengan una excelente resistencia y adaptabilidad para garantizar la actividad enzimática y la precisión de replicación en condiciones complejas.

En quinto lugar, la muestra de tejido objetivo de la tecnología de PCR directa sin ningún tratamiento de enriquecimiento de ácido nucleico y la cantidad de plantilla es muy pequeña, lo que requiere que el sistema de reacción tenga una sensibilidad y una eficiencia de amplificación extremadamente altas.