Sin señales de amplificación

1. La ADN polimerasa Taq del kit pierde su actividad debido a un almacenamiento inadecuado oa la caducidad del kit.
Recomendación: Confirmar las condiciones de almacenamiento del kit;vuelva a agregar una cantidad adecuada de Taq DNA Polymerase al sistema de PCR o compre un nuevo kit de PCR en tiempo real para experimentos relacionados.

2. Hay muchos inhibidores de la ADN polimerasa Taq en la plantilla de ADN.
Sugerencia: Vuelva a purificar la plantilla o reduzca la cantidad de plantilla utilizada.

3. La concentración de Mg2+ no es adecuada.
Recomendación: La concentración de Mg2+ de la Mezcla Real PCR 2× que proporcionamos es de 3,5 mM.Sin embargo, para algunos cebadores y plantillas especiales, la concentración de Mg2+ puede ser mayor.Por lo tanto, puede agregar directamente MgCl2 para optimizar la concentración de Mg2+.Se recomienda aumentar el Mg2+ 0,5 mM cada vez para la optimización.

4. Las condiciones de amplificación por PCR no son adecuadas y la secuencia o concentración del cebador no es adecuada.
Sugerencia: confirme la corrección de la secuencia del cebador y que el cebador no se haya degradado;si la señal de amplificación no es buena, intente reducir la temperatura de hibridación y ajuste la concentración del cebador de manera adecuada.

5. La cantidad de plantilla es demasiado pequeña o demasiado.
Recomendación: Realice la dilución del gradiente de linealización de plantilla y seleccione la concentración de plantilla con el mejor efecto de PCR para el experimento de PCR en tiempo real.

NTC tiene un valor de fluorescencia demasiado alto

1. Contaminación del reactivo causada durante el funcionamiento.
Recomendación: Reemplazar con nuevos reactivos para experimentos de PCR en tiempo real.

2. Ocurrió contaminación durante la preparación del sistema de reacción de PCR.
Recomendación: Tome las medidas de protección necesarias durante la operación, tales como: usar guantes de látex, usar una punta de pipeta con filtro, etc.

3. Los cebadores se degradan y la degradación de los cebadores provocará una amplificación no específica.
Sugerencia: utilice la electroforesis SDS-PAGE para detectar si los cebadores están degradados y reemplácelos con nuevos cebadores para los experimentos de PCR en tiempo real.

Primer dímero o amplificación no específica

1. La concentración de Mg2+ no es adecuada.
Recomendación: La concentración de Mg2+ del 2× Real PCR EasyTM Mix que proporcionamos es de 3,5 mM.Sin embargo, para algunos cebadores y plantillas especiales, la concentración de Mg2+ puede ser mayor.Por lo tanto, puede agregar directamente MgCl2 para optimizar la concentración de Mg2+.Se recomienda aumentar el Mg2+ 0,5 mM cada vez para la optimización.

2. La temperatura de recocido de la PCR es demasiado baja.
Sugerencia: aumente la temperatura de recocido de PCR en 1 ℃ o 2 ℃ cada vez.

3. El producto PCR es demasiado largo.
Recomendación: la duración del producto de PCR en tiempo real debe estar entre 100 y 150 pb, no más de 500 pb.

4. Los cebadores se degradan y la degradación de los cebadores dará lugar a la aparición de una amplificación específica.
Sugerencia: utilice la electroforesis SDS-PAGE para detectar si los cebadores están degradados y reemplácelos con nuevos cebadores para los experimentos de PCR en tiempo real.

5. El sistema de PCR no es adecuado o el sistema es demasiado pequeño.
Sugerencia: si el sistema de reacción de PCR es demasiado pequeño, la precisión de detección disminuirá.Es mejor utilizar el sistema de reacción recomendado por el instrumento de PCR cuantitativa para volver a ejecutar el experimento de PCR en tiempo real.

Mala repetibilidad de los valores cuantitativos

1. El instrumento no funciona correctamente.
Sugerencia: Puede haber errores entre cada orificio de PCR del instrumento, lo que resulta en una mala reproducibilidad durante la detección o el control de la temperatura.Por favor verifique de acuerdo con las instrucciones del instrumento correspondiente.

2. La pureza de la muestra no es buena.
Recomendación: las muestras impuras darán lugar a una mala reproducibilidad del experimento, lo que incluye la pureza de la plantilla y los cebadores.Lo mejor es volver a purificar la plantilla y los cebadores se purifican mejor mediante SDS-PAGE.

3. El tiempo de preparación y almacenamiento del sistema PCR es demasiado largo.
Sugerencia: Utilice el sistema de PCR en tiempo real para el experimento de PCR inmediatamente después de la preparación y no lo deje a un lado por mucho tiempo.

4. Las condiciones de amplificación por PCR no son adecuadas y la secuencia o concentración del cebador no es adecuada.
Sugerencia: confirme la corrección de la secuencia del cebador y que el cebador no se haya degradado;si la señal de amplificación no es buena, intente reducir la temperatura de hibridación y ajuste la concentración del cebador de manera adecuada.

5. El sistema de PCR no es adecuado o el sistema es demasiado pequeño.
Sugerencia: si el sistema de reacción de PCR es demasiado pequeño, la precisión de detección disminuirá.Es mejor utilizar el sistema de reacción recomendado por el instrumento de PCR cuantitativa para volver a ejecutar el experimento de PCR en tiempo real.